王 微，華 敏，張 蕓，李 濤，張黔東，袁 陽(yáng)，程振濤，4，文 明，4*

(1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴陽(yáng) 550025；2.貴州省畜禽遺傳資源管理站，貴陽(yáng)550025；3.貴州省動(dòng)物預(yù)防控制中心，貴陽(yáng)550025；4.貴州省動(dòng)物生物制品工程技術(shù)研究中心，貴陽(yáng) 550025)

鴨瘟病毒(duck plague virus，DPV)又稱為鴨病毒性腸炎病毒(duck enteritis virus，DEV)，屬皰疹病毒科成員。DEV傳播速度快且病死率較高，常引起鴨、鵝等禽類發(fā)生急性、敗血性、高度接觸性傳染病，造成了養(yǎng)殖戶嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。病禽往往表現(xiàn)為精神不振，綠色稀糞，頭部腫脹，兩腳麻痹不能站立；其病變特征為組織、消化道出血壞死，血管損傷，淋巴器官特異性病變和實(shí)質(zhì)性臟器退行性病變。

絲切蛋白(cofilin)是肌動(dòng)蛋白解聚因子(actin depolymerizing factor，ADF)/cofilin家族的一員，在哺乳動(dòng)物神經(jīng)元中主要通過(guò)切斷或穩(wěn)定肌動(dòng)蛋白絲以影響肌動(dòng)蛋白組裝的動(dòng)力學(xué)[1]。病原微生物進(jìn)入宿主細(xì)胞并在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)需要肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架，cofilin與細(xì)胞骨架的正常結(jié)構(gòu)、動(dòng)力學(xué)和功能有關(guān)，因此對(duì)病原微生物進(jìn)入宿主細(xì)胞有著重要的影響[2-3]。cofilin蛋白有2種：cofilin1和cofilin2[4]。cofilin1在細(xì)胞遷移、增殖和噬菌體形成中起作用；cofilin1以及cofilin2在病毒復(fù)制過(guò)程中表達(dá)方式不同[5-7]。cofilin2主要是在真核細(xì)胞中表達(dá)，它結(jié)合并解聚肌動(dòng)蛋白絲來(lái)對(duì)細(xì)胞的生理功能進(jìn)行調(diào)節(jié)，其在細(xì)胞中的活性受磷酸化、去磷酸化和pH的調(diào)節(jié)[8]。cofilin2在肌肉發(fā)育和功能作用尚不清楚，但可能參與了肌纖維發(fā)生過(guò)程中肌動(dòng)蛋白組裝的調(diào)節(jié)和成熟肌肉中的肌動(dòng)蛋白動(dòng)力學(xué)[9]。RNA干擾(RNA interference，RNAi)是由正義RNA和反義RNA組成高度保守的小型雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)導(dǎo)入細(xì)胞中誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象，dsRNA分為miRNA(micro RNA)，siRNA(small interfering RNA，siRNA)和shRNA(short hairpin RNA，shRNA)[10-11]。shRNA是一種具有發(fā)夾環(huán)的人工RNA分子，可克隆成表達(dá)載體，在宿主細(xì)胞中RNA聚合酶作用下導(dǎo)致較長(zhǎng)時(shí)間的基因沉默[12-14]。此外，由于它們發(fā)夾結(jié)構(gòu)有穩(wěn)定基因表達(dá)的潛力，它們有利于體內(nèi)研究，是一種實(shí)用工具[15-16]。盡管近年來(lái)對(duì)DEV的研究進(jìn)展為病毒發(fā)病的基本機(jī)制提供了新的認(rèn)識(shí)，但有關(guān)RNAi 干擾cofilin2基因?qū)EV增殖的影響研究鮮有報(bào)道。研究cofilin2基因?qū)EV在宿主細(xì)胞內(nèi)增殖過(guò)程的影響，對(duì)DEV的研究致病機(jī)理以及疾病防控具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株、載體及細(xì)胞 DEV-GZ株及DEF由本實(shí)驗(yàn)室提供；pGPH1/GFP/Neo表達(dá)載體及shRNA質(zhì)粒購(gòu)自吉瑪生物有限公司；感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌DH5α菌株購(gòu)自天根生化科技有限公司。

1.1.2 主要試劑 Lipofectamine? 3000購(gòu)自Invitrogen公司；胰蛋白酶及DMEM購(gòu)自Nalgen公司；FBS購(gòu)自賽默飛世爾科技公司；Prime ScriptTMRT Master Mix、SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ購(gòu)自TaKaRa公司；UNIQ-10無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司，其他試驗(yàn)所需試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 shRNA干擾載體序列設(shè)計(jì) 通過(guò)Ambion在線軟件設(shè)計(jì)篩選鴨源cofilin2全基因序列(MF434775)中4條特異性shRNA序列，并加入5′-TTCAAGAGA-3′序列形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。4條shRNA序列中靶序列起始位置分別為460～480、313～333、256～276、95～115，根據(jù)靶序列起始位置不同將shRNA干擾載體分別命名為cofilin2-451、cofilin2-304、cofilin2-247、cofilin2-86；設(shè)計(jì)1條陰性對(duì)照并命名為shRNA-NC，靶序列及shRNA序列詳見表1。

表1 cofilin2基因shRNA序列

1.2.2 shRNA干擾載體構(gòu)建 oligo混合物制備(正義鏈、反義鏈各5 μL，10×oligo annealing buffer 2 μL，ddH2O補(bǔ)足20 μL)；將制備好的oligo混合物95 ℃加熱5 min，冷卻放置一段時(shí)間使其形成DNA雙鏈并稀釋至10 nmol·L-1待用。分別按照5×ligation buffer 4 μL、ds oligo 4 μL、pGPH1/GFP/Neo 2 μL、T4 DNA ligase(1 U·μL-1)1 U的順序逐步加入，ddH2O補(bǔ)足20 μL；室溫條件下放置30 min(使質(zhì)粒能夠充分轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中)。將制備好的shRNA載體涂布于含有奇霉素的LB固體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h以篩選出轉(zhuǎn)化成功的DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取平板上的單個(gè)菌落于LB肉湯中，180 r·min-137 ℃恒溫?fù)u床中增菌12 h后，離心收集菌體。提取質(zhì)粒中的DNA送生工生物工程(上海)公司測(cè)序，分析shRNA干擾載體是否構(gòu)建成功。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 DEF制備：受精鴨蛋孵化至10日齡，取胚體的軀干剪碎加入胰蛋白酶吹打離心，棄掉上清，轉(zhuǎn)入3 mL DMEM培養(yǎng)基中吹打，用過(guò)濾器過(guò)濾并收集細(xì)胞液，轉(zhuǎn)入含雙抗+10% FBS的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，放入5%CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)至細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底。shRNA及Lipofectamin? 3000(1∶1)各125 μL混勻，室溫放置5 min后，緩慢將Lipofectamine? 3000-shRNA復(fù)合物加入到已經(jīng)轉(zhuǎn)入生長(zhǎng)良好的DEF六孔板中，將六孔板放置于5%CO2培養(yǎng)箱37 ℃孵育。

1.2.4 shRNA干擾載體的篩選 將cofilin2-451、cofilin2-304、cofilin2-247、cofilin2-86及shRNA-NC 5個(gè)干擾載體，按“1.2.3”方法轉(zhuǎn)染到DEF中。經(jīng)轉(zhuǎn)染24 h后放置于熒光顯微鏡上觀察重組質(zhì)粒中GFP基因是否出現(xiàn)綠色熒光蛋白表達(dá)。確定細(xì)胞生長(zhǎng)良好及GFP正常表達(dá)后，經(jīng)熒光定量PCR檢測(cè)4對(duì)shRNA干擾效果并進(jìn)行shRNA的篩選，F(xiàn)Q-PCR反應(yīng)體系: SYBR premix Ex Taq Ⅱ(Til RNaseH Plus)(2×)5.0 μL，PCR 上、下游引物各0.5 μL, DNA模板1.0 μL, 加ddH2O至10 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s、55 ℃退火30 s，共循環(huán)40次；在退火時(shí)采集5 s熒光，采集熔解曲線，溫度范圍為60～95 ℃，溫度臺(tái)階為0.5 ℃。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒shRNA的構(gòu)建

靶向設(shè)計(jì)shRNA序列插入到載體中，通過(guò)Sanger測(cè)序比對(duì)結(jié)果顯示，由于shRNA序列中靶序列起始位置不同，分別將shRNA干擾載體命名為cofilin2-451、cofilin2-304、cofilin2-247、cofilin2-86，測(cè)序結(jié)果見表2，shRNA干擾質(zhì)粒構(gòu)建成功。

表2 shRNA質(zhì)粒測(cè)序

2.2 shRNA序列篩選

應(yīng)用EXCEL軟件對(duì)shRNA序列篩選。

2.2.1 shRNA干擾質(zhì)粒篩選熒光表達(dá)結(jié)果 轉(zhuǎn)染24 h于普通顯微鏡觀察shRNA干擾質(zhì)粒，其在DEF中生長(zhǎng)良好；經(jīng)24 h培養(yǎng)后重組質(zhì)粒載體中GFP基因顯示綠色熒光蛋白熒光(圖1)，DMEM中未見綠色熒光蛋白熒光，說(shuō)明DMEM不表達(dá)，重組質(zhì)粒中GFP基因表達(dá)轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒成功。

A.轉(zhuǎn)染shRNA質(zhì)粒DEF生長(zhǎng)情況圖；B.轉(zhuǎn)染24 h后shRNA質(zhì)粒熒光圖

2.2.2 shRNA篩選FQ-PCRcofilin2核酸含量檢測(cè)結(jié)果 通過(guò)FQ-PCR檢測(cè)篩選mRNA水平shRNA的干擾效果，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒cofilin2-451、cofilin2-304、cofilin2-247、cofilin2-86后DEF中cofilin2轉(zhuǎn)錄量，均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，沉默效率分別為4.96%±0.78%、41.12%±2.94%、17.55%±2.07%、54.02%±1.73%；而陰性對(duì)照為4.52%±0.99%，試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)cofilin2-86干擾組中干擾效果最好，選擇其作為后續(xù)試驗(yàn)使用，shRNA篩選FQ-PCR檢測(cè)結(jié)果見圖2。

*.P<0.05

2.3 cofilin2-86干擾下DEV增殖動(dòng)態(tài)

六孔板中轉(zhuǎn)染cofilin2-86的DEF生長(zhǎng)至適宜密度時(shí)，于48、72、96、120 h 4個(gè)時(shí)間段收集細(xì)胞，cofilin2-86在轉(zhuǎn)染后4個(gè)時(shí)間段的干擾效率分別為50.42%±2.02%、56.24%±1.94%、55.34%±0.98%、42.59%±4.32%(圖3)。通過(guò)FQ-PCR檢測(cè)DEV-GZ株處理DEF后不同時(shí)間段收集的細(xì)胞液中DEV核酸表達(dá)量，cofilin2 shRNA+DEV試驗(yàn)組顯著低于DMEM+DEV組(P<0.05)(圖4)。DMEM+DEV組中DEV核酸量隨著時(shí)間增加而增加，DMEM中的DEV未見表達(dá)，cofilin2 shRNA+DEV組中DEV隨時(shí)間增加而增加，但明顯低于與DMEM+DEV中的DEV核酸量，說(shuō)明沉默cofilin2導(dǎo)致DEV核酸復(fù)制被抑制，cofilin2可能促進(jìn)DEV的復(fù)制，這與Li等[17]研究的cofilin2具有免疫性和促進(jìn)細(xì)胞增殖作用相一致。

圖3 cofilin2-86轉(zhuǎn)染不同時(shí)間的表達(dá)情況

與DMEM+DEV組相比，*.P<0.05

3 討 論

在任何生物調(diào)節(jié)過(guò)程中，轉(zhuǎn)錄調(diào)控都是至關(guān)重要的部分，RNAi技術(shù)能夠廣泛應(yīng)用于傳染性、腫瘤性疾病治療，是因?yàn)槟芸寺〉絪hRNA表達(dá)載體中以穩(wěn)定靶基因和干擾目的基因表達(dá)。RNAi的作用機(jī)制是通過(guò)在細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入dsRNA，dsRNA能夠特異性地與細(xì)胞內(nèi)互補(bǔ)的mRNA結(jié)合使其降解，以阻止mRNA編碼蛋白質(zhì)，從而使細(xì)胞中目的基因的表達(dá)量減少[18-20]。大多數(shù)無(wú)法轉(zhuǎn)染的細(xì)胞、腺病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒，可利用RNAi中短發(fā)卡結(jié)構(gòu)的shRNA克隆到載體再進(jìn)行轉(zhuǎn)染[21]。復(fù)制腺病毒作為shRNA的傳遞載體可增強(qiáng)抗腫瘤效果[22]。RNAi技術(shù)面臨的主要問(wèn)題就是脫靶效應(yīng)，通過(guò)設(shè)計(jì)無(wú)法進(jìn)行化學(xué)修飾表達(dá)的shRNA可有效降低脫靶效應(yīng)發(fā)生[23-24]。shRNA主要存在的問(wèn)題是轉(zhuǎn)染效率，由于不完全的轉(zhuǎn)染產(chǎn)生不完整的mRNA，可能影響了蛋白的功能[25]。研究運(yùn)用RNAi技術(shù)針對(duì)cofilin2設(shè)計(jì)的4段shRNA片段進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，以期篩選穩(wěn)定沉默cofilin2基因的靶序列。結(jié)合轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒結(jié)果，在今后的DEV研究中，采用干擾效率高且穩(wěn)定性好的cofilin2-86質(zhì)粒作為載體更合理。

cofilin2的缺乏可能導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白表達(dá)降低，也可以改變細(xì)胞功能，在細(xì)胞內(nèi)積累導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[26]。已被證明與肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白相互作用，這可能與cofilin2在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和凋亡中有絲分裂紡錘體形成過(guò)程有關(guān)[27]。Yu等[28]研究利用cofilin2-shRAN干擾載體轉(zhuǎn)染到移植腫瘤的裸鼠模型中可有效表達(dá)，cofilin2基因沉默抑制了腫瘤生長(zhǎng)，表明cofilin2可作為鼻咽癌的潛在治療靶點(diǎn)。Gao等[29]研究在腫瘤腺病毒中shRNA與黏附斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)結(jié)合形成FAK-shRNA復(fù)合物，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后顯著抑制了FAK的表達(dá)，并有效抑制了肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)且對(duì)正常細(xì)胞無(wú)影響。證明RNAi在疾病治療中對(duì)癌癥和病毒感染效果顯著，研究cofilin2對(duì)探究病毒復(fù)制具有重要的意義。本研究將cofilin2-86作為載體轉(zhuǎn)染到DEF中，DEV病毒核酸量隨著時(shí)間的推移持續(xù)增長(zhǎng)，cofilin2基因?qū)EV的增殖有促進(jìn)作用，同時(shí)，也存在其他基因影響DEV增殖還有待研究。Zhao等[30]研究利用鴨乙型肝炎病毒感染原發(fā)性鴨肝細(xì)胞蛋白組分析中，在感染細(xì)胞過(guò)程中存在75個(gè)不同蛋白表達(dá)靶點(diǎn)，其中,β-actin和膜聯(lián)蛋白A2的差異表達(dá)，這些蛋白表達(dá)差異在病毒感染中存在潛在作用，同樣在DEV復(fù)制增殖過(guò)程中存在的其他蛋白表達(dá)靶點(diǎn)具有重要的研究意義。

4 結(jié) 論

通過(guò)將沉默cofilin2轉(zhuǎn)染到DEF中，cofilin2-86在轉(zhuǎn)染后4個(gè)時(shí)間段中最佳干擾效率為56.24%±1.94%，利用干擾效率最佳的cofilin2-86轉(zhuǎn)染到DEF中，在不同時(shí)間DEV處理DEF下，DEV核酸量較轉(zhuǎn)染對(duì)照組中的DEV核酸量總體下降，推測(cè)cofilin2基因?qū)EV的增殖存在促進(jìn)作用，該結(jié)果為今后cofilin2對(duì)DEV動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)錄研究奠定了基礎(chǔ)。