王秋菊

作者單位：許昌市人民醫(yī)院NICU，河南 許昌461000

肺炎支原體肺炎（mycoplasma pneumoniae pneu?monia，MPP）是小兒常見的呼吸道感染，支原體感染不僅引起呼吸道的炎性改變，也可引起全身炎性反應(yīng)綜合征，甚至導(dǎo)致多器官功能的損害［1-2］。在MPP的進(jìn)展過程中，炎癥反應(yīng)及其相關(guān)的器官功能損害具有重要的作用。長(zhǎng)鏈非編碼RNA MALAT1（Long non-coding RNA MALAT1，LncRNA MALAT1）可通過調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡等生物學(xué)過程從而參與多種疾病發(fā)生及發(fā)展過程。研究表明，MALAT1 在特異性感染過程中，參與炎癥反應(yīng)的過程，與病情的進(jìn)展有關(guān)［3-4］。并且能夠通過調(diào)控微小RNA-125b（mi?croRNA-125b，miR-125b）的表達(dá)從而參與炎癥進(jìn)展及器官功能損害的過程［5］。本研究就不同病情及病程MPP 病兒血清LncRNA MALAT1、miR-125b 表達(dá)情況進(jìn)行研究，為MPP 病情及預(yù)后的評(píng)估提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2016 年4 月至2018 年6 月許昌市人民醫(yī)院收治的MPP病兒40例（MPP組），其中男23 例，女17 例，年齡（4.56±2.13）歲，范圍為1～8歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）MPP 急性期符合《兒童肺炎支原體肺炎診治專家共識(shí)（2015 年版）》［6］中診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）病兒近親屬自愿納入研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并其他部位感染；（2）合并免疫系統(tǒng)疾??；（3）合并心血管系統(tǒng)畸形或肺結(jié)核等其他病原菌感染。病兒病情輕型26 例，重型［7-8］14 例。選擇同期該院體檢的健康兒童40 例作為對(duì)照組，男22 例，女18 例，年齡（5.19±3.22）歲，范圍為1～10 歲。兩組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 方法

1.2.1標(biāo)本采集 對(duì)照組入組后采集空腹靜脈血3 mL，MPP組病人入組后及治療進(jìn)入緩解期后分別采集空腹靜脈血3 mL，血液樣本置于離心管內(nèi)，4 ℃條件下經(jīng)3 000 r/min離心5 min，分離血清，置于?80 ℃超低溫冰箱保存，分批檢測(cè)。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRTPCR）檢測(cè)LncRNA MALAT1、miR-125b 的表達(dá)水平 對(duì)照組入組后、病兒入組后及病情進(jìn)入緩解期后采用Trizol 試劑提取血清中總RNA，應(yīng)用Nano?drop2000c 超微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA 濃度，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)DNA（cDNA）。MALAT1 正向引物5’-CTTAAGC?GCAGCGCCATTTT-3’，反向引物 5’-CCTC?CAAACCCCAAGACCAA-3’；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）正向引物5’-GCACCGTCAAGGCTGAGA?AC-3’，反向引物5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’；miR-125b 正向引物5’-ATCACAGGTCAG?GCTCTTGG-3’，反向引物5’-ACGTCAGATAGC?TAGCTCTACG-3’；U6 正向引物5’-ATTGGAAC?GATACAGAGAAGATT-3’，反向引物5’-GGAAC?GCTTCACGAATTTG-3’，引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。qRT-PCR 反應(yīng)體系：SYBR Green Master Mix 10 μL，正反向引物0.8 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 補(bǔ)足體系至20 μL；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共循環(huán)40 次。置于ABI 7500 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀檢測(cè)，LncRNA MALAT1 以GAPDH 為內(nèi)參，miR-125b 以U6 為內(nèi)參，采用2?ΔΔCt法LncRNA MALAT1、miR-125b 相對(duì)表達(dá)量。Trizol 試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒與熒光定量PCR 試劑盒均購(gòu)自北京天根生化科技有限公司。

1.2.3 檢測(cè)血清CRP、IL-6 及TNF-α 檢測(cè) 病兒及對(duì)照組入組后應(yīng)用P800型全自動(dòng)生化分析儀（瑞士羅氏公司）檢測(cè)血清C 反應(yīng)蛋白（CRP）水平，檢測(cè)方法為比濁法，由該院檢驗(yàn)科完成檢測(cè)；采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）檢測(cè)血清白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平，檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海博谷生物科技有限公司，檢測(cè)過程嚴(yán)格按照試劑及儀器使用說明書進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 21.0 進(jìn)行分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Pearson相關(guān)性分析檢驗(yàn)變量之間的相關(guān)性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組兒童血清MALAT1、miR-125b 的表達(dá)量比較與對(duì)照組相比，MPP 組血清MALAT1 的表達(dá)水平升高［（2.13±0.16）比（1.00±0.10），t=37.89，P<0.001］，miR-125b 的表達(dá)水平降低［（0.52±0.11）比（1.01±0.13），t=18.20，P<0.001］。

2.2 不同病情MPP 病兒血清MALAT1、miR-125b的表達(dá)量比較輕癥型MPP 病人血清MALAT1 表達(dá)量低于重癥型［（1.62±0.23）比（2.97±0.31），t=15.65，P<0.001］，miR-125b 表達(dá)量高于重癥型［（0.77±0.13）比（0.32±0.07），t=12.00，P<0.001］。

2.3 兩組兒童血清CRP、IL-6、TNF-α 水平比較與對(duì)照組相比，MPP 組病兒血清CRP、IL-6、TNF-α水平升高（P<0.05），見表1。

表1 兩組兒童血清CRP、IL-6、TNF-α水平比較/± s

注：CRP 為C 反應(yīng)蛋白，IL-6 為白細(xì)胞介素-6，TNF-α 為腫瘤壞死因子α，MPP為肺炎支原體肺炎。

例數(shù)40 40 IL-6/（ng/L）13.21±3.98 35.26±8.52 14.83<0.001組別對(duì)照組MPP組t值P值CRP/（mg/L）3.22±1.16 11.16±3.13 15.04<0.001 TNF-α/（ng/L）14.32±4.21 32.31±8.57 11.92<0.001

2.4 MPP 病兒血清LncRNA MALAT1、miR-125b的表達(dá)量與CRP、IL-6、TNF-α的相關(guān)性Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示LncRNA MALAT1 表達(dá)量與CRP、IL-6、TNF-α 呈正相關(guān)，miR-125b 的表達(dá)量與CRP、IL-6、TNF-α呈負(fù)相關(guān)（P<0.05），見表2。

表2 MPP病兒40例血清LncRNA MALAT1、miR-125b的表達(dá)量與CRP、IL-6、TNF-α的Pearson相關(guān)性分析結(jié)果

3 討論

LncRNA MALAT1 是定位于細(xì)胞核核小體核斑區(qū)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA，是一個(gè)高度保守序列，雖然不具有蛋白編碼功能，但能夠通多多種形式實(shí)現(xiàn)對(duì)功能蛋白轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后功能進(jìn)行調(diào)控。LncRNA MALAT1 對(duì)細(xì)胞的增殖及遷徙能力具有促進(jìn)作用，在腫瘤的進(jìn)展及轉(zhuǎn)移中具有重要作用。miR-125b是內(nèi)源性的非編碼微小RNA，能夠通過與mRNA 的結(jié)合抑制或誘導(dǎo)蛋白的翻譯，進(jìn)而發(fā)揮生物活性作用。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA 生物活性作用的發(fā)揮不僅包括對(duì)mRNA 活性的調(diào)節(jié)，也包括對(duì)Ln?cRNA 的調(diào)控作用。在對(duì)口腔鱗癌的細(xì)胞及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，LncRNA MALAT1 能夠通過對(duì)miR-125b靶點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖［9］，在對(duì)膿毒血癥等嚴(yán)重感染模型的觀察中也發(fā)現(xiàn)，miR-125b是LncRNA MALAT1 作用的靶點(diǎn)，LncRNA MALAT1能夠通過對(duì)miR-125b 的調(diào)控，引起TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-17 等炎性遞質(zhì)表達(dá)水平的變化［5］。miR-125b 可通過靶向SPDEF 表達(dá)從而抑制過敏性氣道炎癥反應(yīng)的發(fā)生［10］。研究表明miR-125b 可參與單核細(xì)胞炎癥反應(yīng)發(fā)生過程，抑制炎性遞質(zhì)對(duì)單核細(xì)胞的趨化和激活［11］。在對(duì)本組的資料觀察發(fā)現(xiàn)，MALAT1 在MPP 病兒中的表達(dá)上調(diào)，隨著疾病的發(fā)展MALAT1 的表達(dá)量顯著升高，提示MALAT1表達(dá)量升高可能促進(jìn)MPP 的發(fā)生。MPP 病兒血清miR-125b 表達(dá)水平降低，而且重型病兒的miR-125b降低得更為明顯。提示miR-125b 表達(dá)量降低可能與MMP的進(jìn)展有關(guān)，其表達(dá)的下降可能導(dǎo)致氣道的高反應(yīng)性，進(jìn)而影響呼吸道的功能及痰液的排出，加重臨床癥狀，在病兒進(jìn)入緩解期后血清的Ln?cRNAMALAT1 水平降低，而miR-125b 水平升高，提示LncRNAMALAT1與miR-125b在MPP的發(fā)生及發(fā)展過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。

研究表明CRP 在全身炎癥綜合征等疾病中的含量增加，在機(jī)體感染后CRP 水平明顯升高，其高表達(dá)量隨著疾病嚴(yán)重程度的增加而顯著升高［12-13］。本研究結(jié)果顯示MPP 病兒血清CRP 水平明顯升高，與上述研究結(jié)果相似。IL-6、TNF-α 屬于促炎性細(xì)胞因子，其水平升高與MPP密切相關(guān)［14-17］。

本研究結(jié)果顯示MPP 病兒血清IL-6、TNF-α 水平明顯升高，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相似［18］。提示IL-6、TNF-α 水平升高導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)在MPP 的病情進(jìn)展中具有重要的作用。本研究結(jié)果顯示MALAT1表達(dá)量與CRP、IL-6、TNF-α 呈正相關(guān)，miR-125b 的表達(dá)量與CRP、IL-6、TNF-α 呈負(fù)相關(guān)，提示血清MALAT1、miR-125b 表達(dá)與MPP 病兒免疫反應(yīng)及炎癥反應(yīng)的發(fā)生密切。隨著血清LncRNAMALAT1 水平的升高與miR-125b水平的降低，MPP 病兒感染嚴(yán)重程度明顯增加，提示LncRNAMALAT1 與miR-125b 水平變化可通過調(diào)控炎癥反應(yīng)從而參與MPP發(fā)生及發(fā)展過程。

綜上所述，MPP 病兒血清miR-125b 的表達(dá)水平明顯升高，miR-125b 的表達(dá)水平明顯降低，二者表達(dá)量變化與MPP 病情及進(jìn)展密切相關(guān)，MALAT1 與miR-125b可能作為評(píng)估MPP 疾病進(jìn)展的重要指標(biāo)。但關(guān)于MALAT1 與miR-125b 在MPP 發(fā)生及發(fā)展過程中的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。