周瑞，唐志書，蘇潔，任美，任素娟，劉妍如，潘亞磊，宋忠興（陜西中醫(yī)藥大學(xué)/陜西中藥資源產(chǎn)業(yè)化省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心/秦藥特色資源研究開發(fā)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（培育）/陜西省創(chuàng)新藥物研究中心，陜西 咸陽 712083）

放療是臨床上治療腫瘤的重要手段，而機(jī)體經(jīng)過多次輻照，射線在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，對(duì)正常組織也會(huì)造成不可逆的損傷。文獻(xiàn)報(bào)道輻照會(huì)導(dǎo)致水電解為氧化自由基，從而對(duì)機(jī)體細(xì)胞產(chǎn)生不可逆轉(zhuǎn)的氧化應(yīng)激損傷。血管內(nèi)皮細(xì)胞是輻照誘發(fā)機(jī)體損傷的重要防御細(xì)胞，也是最易受到氧化損傷的細(xì)胞，因而，是用于體外研究藥物抗氧化損傷的理想模型。

正源方是由西洋參、仙鶴草、南沙參、當(dāng)歸、重樓組方而成的臨床經(jīng)驗(yàn)方，是根據(jù)李東垣《內(nèi)外病辨惑論》中的“當(dāng)歸補(bǔ)血湯”加減而來的，即原方去黃芪后，加西洋參、南沙參、仙鶴草、重樓而成，在臨床已經(jīng)應(yīng)用近20年，其主要功效為益氣養(yǎng)陰、清熱解毒，對(duì)于惡性腫瘤放療及特殊輻射損傷引起的血小板減少，白細(xì)胞下降，毛發(fā)脫落，皮膚紅疹、斑疹、紫癜等癥具有較好的療效，能有效改善放療后氣血虧虛患者中醫(yī)證候表現(xiàn)，并且緩解患者因放療引起的毒副作用。前期本課題組完成了正源方的提取工藝研究及特征指紋圖譜建立，也有研究證實(shí)了正源方對(duì)輻射動(dòng)物和化療引起的動(dòng)物損傷具有較好的治療效果。但是，正源方的體外抗氧化損傷作用尚不明確。因此，本文通過過氧化氫（HO）誘導(dǎo)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）構(gòu)建氧化損傷模型，探討正源方對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制，為其抗輻射作用及臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞

HUVEC（北京吉納生物科技有限公司）。

1.2 試藥

正源方的提取及制備方法參考文獻(xiàn)，Ham’s F-12K 培養(yǎng)基（武漢普諾賽生命科技有限公司）；胎牛血清、青鏈霉素混合液（Biological Industries）；30%HO、MTT、二甲基亞砜（DMSO）（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；ECL 超敏發(fā)光液（上海天能科技有限公司）；羅丹明123 檢測(cè)試劑盒、活性氧檢測(cè)試劑盒（碧云天生物）；乳酸脫氫酶（LDH）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：A020-2-2）、總超氧化物歧化酶（T-SOD）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：A001-1-1）及丙二醛（MDA）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：A003-4-1）（南京建成生物工程材料有限公司）；RIPA 細(xì)胞裂解液（批號(hào)：HJ194302）、BCA 蛋白定量試劑盒（批號(hào)：U9229）（天根生物科技有限公司）；p-38 蛋白抗體、p-p38 蛋白抗體（萬類生物）；p-JNK 蛋白抗體、JNK 蛋白抗體、p-ERK 蛋白抗體（Cell signaling Techenology 公司）；ERK 蛋白抗體、兔二抗（美國Proteintech 公司）。

1.3 儀器

細(xì)胞培養(yǎng)箱、全波長酶標(biāo)儀（美國賽默飛世爾科技公司）；相差顯微鏡（重慶中顯光電儀器有限公司）；IX73 倒置熒光顯微鏡（日本奧林巴斯）；超潔凈工作臺(tái)（蘇凈安泰儀器有限公司）；流式細(xì)胞儀（美國BD 公司）；凝膠電泳儀和凝膠成像儀、電泳條帶灰度值分析軟件Image Lab（美國Bio-Rad 公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

HUVEC 的培養(yǎng)基組成為89% Ham’s F-12K培養(yǎng)基，10%胎牛血清和1%雙抗，培養(yǎng)箱條件為37℃、5%CO。

2.2 正源方提取液的制備

正源方提取液的制備參考文獻(xiàn)方法。稱取干燥的正源方粉末10 mg，用1 mL PBS 超聲條件下溶解，配制成 10 mg·mL的母液，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 正源方對(duì)細(xì)胞存活率的影響

將生長良好的HUVEC 按5×10個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于96 孔板中，過夜。分為5 組：對(duì)照組、模型組（500 μmol·LHO）、正源方低劑量組（50 μg·mL）、正源方中劑量組（100 μg·mL）和正源方高劑量組（200 μg·mL）。不同質(zhì)量濃度正源方預(yù)培養(yǎng)3 h 后，加入500 μmol·LHO，培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌2 次， 每孔加入100 μL MTT 溶液（0.5 mg·mL），4 h 后每孔加入 150 μL DMSO，在490 nm 處采用酶標(biāo)儀檢測(cè)各樣本吸光度（

A

），計(jì)算細(xì)胞存活率。

2.4 正源方對(duì)H2O2 誘導(dǎo)的細(xì)胞線粒體膜電位的影響

將生長良好的HUVEC 按1×10個(gè)細(xì)胞/孔的濃度接種于6 孔板中。同“2.3”項(xiàng)下分為5 組。正源方預(yù)處理細(xì)胞3 h 后，加入500 μmol·LHO，培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)基，PBS 洗滌2 次，加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min，PBS 清洗2遍，避光條件下，在37℃中加入2 μmol·L羅丹明123 染色30 min。采用倒置熒光顯微鏡觀察染色的細(xì)胞。使用Image J 1.43 統(tǒng)計(jì)各組中相同面積的十個(gè)區(qū)域的細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度以及相同面積的十個(gè)區(qū)域內(nèi)的平均細(xì)胞數(shù)目。

2.5 正源方對(duì)H2O2 誘導(dǎo)的細(xì)胞產(chǎn)生活性氧（ROS）的影響

將生長良好的HUVEC 按1×10個(gè)細(xì)胞/孔的濃度接種于6 孔板中。分為4 組：空白組（不含熒光探針）、對(duì)照組、HO處理組（500 μmol·L）和正源方處理組（200 μg·mL）。正源方預(yù)處理細(xì)胞3 h 后，加入500 μmol·LHO，培養(yǎng)24 h，用無血清培養(yǎng)基清洗細(xì)胞，用10 mmol·LDCFH-DA 在37℃染色20 min，離心收集細(xì)胞。用無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞，并使用流式細(xì)胞儀（BD Biosciences，San Jose，CA，USA）檢測(cè)各組樣品的熒光強(qiáng)度。

2.6 正源方對(duì)H2O2 誘導(dǎo)的細(xì)胞產(chǎn)生LDH、MDA及SOD 的影響

將生長良好的HUVEC 按1×10個(gè)細(xì)胞/孔的濃度接種于6 孔板中。按“2.3”項(xiàng)下方法分為5 組。正源方預(yù)處理細(xì)胞3 h 后，加入500 μmol·LHO，培養(yǎng)24 h，收集各組細(xì)胞上清液，使用LDH 和T-SOD 檢測(cè)試劑盒，按照試劑盒說明書檢測(cè)LDH 和超氧化物歧化酶（SOD）水平。此外，收集各組細(xì)胞勻漿樣品，細(xì)胞勻漿采用MDA 檢測(cè)試劑盒操作流程對(duì)MDA 水平進(jìn)行檢測(cè)。最后，通過酶標(biāo)儀分別在450、530 及550 nm 下測(cè)定LDH、MDA 和SOD 的吸光度（

A

）。并采用GraphPad Prism Version 5（GraphPad Software，Inc.，CA，美國）進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2.7 正源方對(duì)H2O2 誘導(dǎo)的細(xì)胞中MAPK 通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響

將生長良好的HUVEC 按1×10個(gè)細(xì)胞/孔的濃度接種于6 孔板中。按照“2.3”項(xiàng)下方法分為4 組：對(duì)照組、模型組、正源方中劑量組、正源方高劑量組。正源方預(yù)處理細(xì)胞3 h 后，加入500 μmol·LHO，培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，按照RIPA 裂解液說明書提取蛋白，采用BCA 蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，加入上樣緩沖液，通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）對(duì)等量的蛋白質(zhì)進(jìn)行電泳分離，并將其轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。將膜在室溫下用5%脫脂奶封閉1 h，然后加入p-ERK、ERK、p-JNK、JNK、p-p38 及p38 抗體，4℃孵育過夜，將膜用TBST 洗滌后，加入山羊抗兔二抗，在室溫下孵育40 min。洗滌膜，加入ECL 發(fā)光液，采用凝膠成像系統(tǒng)曝光。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)以至少3 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的

x

±

s

表示。均數(shù)的比較采用單因素方差分析（ANOVA）。使用GraphPad Prism Version 5 對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

P

＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 正源方對(duì)H2O2 誘導(dǎo)的細(xì)胞活力的影響

如圖1 所示，與對(duì)照組相比，500 μmol·LHO處理可顯著降低細(xì)胞活力，而經(jīng)過不同濃度正源方預(yù)處理，可以抑制HO誘導(dǎo)的細(xì)胞活力減少，其中50 ～200 μg·mL呈現(xiàn)濃度依賴性的提高細(xì)胞活力（

P

＜0.001）。結(jié)果表明正源方處理能夠改善HO誘導(dǎo)的細(xì)胞活力減少。

圖1 正源方對(duì)H2O2 誘導(dǎo)的細(xì)胞活力減少的影響Fig 1 Effect of ZYP on the decreased cell viability in H2O2-induced HUVECs

3.2 正源方對(duì)H2O2 誘導(dǎo)的細(xì)胞線粒體膜電位的影響

采用羅丹明123 染色分析細(xì)胞線粒體膜電位的變化，以確定正源方對(duì)細(xì)胞線粒體膜電位的影響。如圖2A 所示，與對(duì)照組相比，HO處理組的細(xì)胞中綠色熒光強(qiáng)度較弱，暗示線粒體膜電位可能受損，而不同濃度正源方預(yù)處理可以增強(qiáng)細(xì)胞中的綠色熒光強(qiáng)度。采用Image J 軟件分析各處理組中10 個(gè)相同面積區(qū)域內(nèi)細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度（見圖2B）和平均細(xì)胞數(shù)量（見圖2C）。通過比較發(fā)現(xiàn)，正源方可以顯著保護(hù)HO誘導(dǎo)的細(xì)胞熒光強(qiáng)度減少（

P

＜0.001）和細(xì)胞數(shù)目減少（

P

＜0.001），提示其可能改善了HO誘導(dǎo)的線粒體功能損傷。

圖2 正源方對(duì)H2O2 誘導(dǎo)的細(xì)胞線粒體膜電位的影響Fig 2 Effect of ZYP on the change of mitochondria membrane potential in H2O2-induced HUVECs

3.3 正源方對(duì)H2O2 誘導(dǎo)的細(xì)胞中ROS 水平的影響

本文通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)正源方對(duì)HO誘導(dǎo)的細(xì)胞中ROS 水平的影響。結(jié)果如圖3A 所示，與對(duì)照組相比，500 μmol·LHO處理細(xì)胞顯著增強(qiáng)了細(xì)胞內(nèi)DCFH-DA 熒光（橘色峰），提示HO誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生過量的ROS。然而200 μg·mL正源方處理后，可以顯著減少細(xì)胞中DCFH-DA 熒光（綠色峰）。通過進(jìn)一步分析每組樣品中的平均熒光強(qiáng)度可知（見圖3B），正源方能夠顯著抑制HO誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS 水平（

P

＜0.001）。結(jié)果表明正源方的抗氧化作用與抑制ROS 水平有關(guān)。

圖3 正源方對(duì)H2O2 誘導(dǎo)的細(xì)胞中ROS 水平的影響Fig 3 Effect of ZYP on the level of ROS in H2O2-induced HUVECs

3.4 正源方對(duì)H2O2 誘導(dǎo)的細(xì)胞中LDH、MDA及SOD 水平的影響

與對(duì)照組相比，經(jīng)500 μmol·LHO處理的細(xì)胞中LDH 和MDA 的水平顯著提高，SOD水平顯著下降，正源方不同濃度處理組可以濃度依賴性地降低HO誘導(dǎo)的LDH 和MDA，提高SOD 水平。結(jié)果表明正源方的抗氧化損傷可能與調(diào)節(jié)氧化因子LDH、MDA 和SOD 水平相關(guān)（見圖4）。

圖4 正源方對(duì)H2O2 誘導(dǎo)的細(xì)胞中LDH、MDA 和SOD 水平的影響Fig 4 Effect of ZYP on the level of LDH，MDA and SOD in H2O2-induced HUVECs

3.5 正源方對(duì)H2O2 誘導(dǎo)的細(xì)胞中MAPK 通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響

結(jié)果如圖5 所示，與對(duì)照組相比，500 μmol·LHO處理可以顯著提高細(xì)胞中MAPK通路關(guān)鍵蛋白p-p38/p38、p-JNK/JNK、p-ERK/ERK 蛋白的表達(dá)，正源方處理后，可以顯著抑制HO誘導(dǎo)的p-p38/p38、p-JNK/JNK、p-ERK/ERK 蛋白表達(dá)。結(jié)果表明，正源方的抗氧化損傷活性可能與調(diào)控MAPK 通路相關(guān)。

圖5 正源方對(duì)H2O2 誘導(dǎo)的細(xì)胞中MAPK 通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響Fig 5 Effect of ZYP on the key proteins expression of MAPK pathway in H2O2-induced HUVECs

4 討論

近年來由于臨床腫瘤患者增多，放射治療和放射損傷引起的毒副作用已不容忽視。正源方可減輕放射治療引起的毒副作用。根據(jù)放射治療可導(dǎo)致機(jī)體過量的氧化應(yīng)激，進(jìn)一步造成機(jī)體的氧化平衡失衡，我們推測(cè)正源方減輕放療引起的毒副作用，可能與其抗氧化應(yīng)激損傷的作用有關(guān)。因此，本文通過構(gòu)建體外氧化應(yīng)激造成的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型，初步評(píng)價(jià)正源方的抗氧化損傷作用及其作用機(jī)制。正源方中含有的人參皂苷Rb及人參皂苷Rg對(duì)氧化應(yīng)激的抑制作用，推測(cè)正源方的抗氧化活性可能是這些化合物的聯(lián)合作用。

輻射產(chǎn)生高水平的ROS，破壞機(jī)體正常的氧化還原平衡，使細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。ROS能使酶失活，氧化蛋白質(zhì)，破壞DNA，引起脂質(zhì)過氧化，使蛋白質(zhì)變性，破壞細(xì)胞功能和完整性。ROS 主要在線粒體中產(chǎn)生并在細(xì)胞輻射過程中發(fā)生積累。因此，抑制機(jī)體氧化應(yīng)激可以起到抗輻射損傷的作用。LDH 是穩(wěn)定存在于細(xì)胞質(zhì)中的胞漿酶，當(dāng)細(xì)胞膜受到氧化損傷時(shí)LDH 釋放，細(xì)胞培養(yǎng)上清中LDH 表達(dá)升高，提示細(xì)胞膜破損。MDA 是自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)的氧化產(chǎn)物，是機(jī)體氧化應(yīng)激的另一個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)，具有細(xì)胞毒性。MDA 的含量可反映機(jī)體脂質(zhì)過氧化速率和程度，同時(shí)間接反映組織過氧化損傷程度。當(dāng)機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激損傷時(shí)，MDA表達(dá)增多。此外，SOD 通過清除機(jī)體有害的超氧陰離子自由基（O），具抗氧化和抗衰老的作用。研究發(fā)現(xiàn)SOD 的產(chǎn)生可以降低ROS 的有害影響。 因此，ROS、LDH、MDA 及SOD 水平在抵御氧化應(yīng)激研究中至關(guān)重要。本研究發(fā)現(xiàn)HO誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞中ROS、LDH 及MDA 水平顯著升高，SOD 水平顯著降低，而不同濃度正源方處理能夠顯著抑制ROS、MDA 和LDH 的過量產(chǎn)生，提高SOD 的表達(dá)水平，表明正源方能夠保護(hù)細(xì)胞免受HO誘導(dǎo)的氧化損傷。

MAPK 通路是參與細(xì)胞氧化應(yīng)激、凋亡、增殖和應(yīng)激反應(yīng)等多種細(xì)胞過程的重要信號(hào)通路。以往研究表明，HO處理可激活血管內(nèi)皮細(xì)胞中的MAPK 通路。ROS 引發(fā)氧化應(yīng)激可以激活MAPK 通路，可以通過磷酸化ERK、JNK 和p38 MAPKs 的表達(dá)水平來監(jiān)測(cè)。研究證實(shí)MAPK 家族信號(hào)通路在調(diào)控HO誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化損傷和凋亡中發(fā)揮重要作用。據(jù)報(bào)道多個(gè)中藥可通過調(diào)控HO誘導(dǎo)的MAPK 通路實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞氧化損傷和凋亡的保護(hù)作用。因此，本文進(jìn)一步檢測(cè)了正源方對(duì)HO誘導(dǎo)的細(xì)胞中MAPK 通路關(guān)鍵蛋白的激活情況。與預(yù)期一致，HO處理組顯著上調(diào)了p-p38/p38、p-JNK/JNK 和p-ERK/ERK 的表達(dá)水平，表明HO處理誘導(dǎo)MAPK 信號(hào)的過度活化，使氧化應(yīng)激水平失衡，線粒體損傷，導(dǎo)致線粒體膜電位下降，細(xì)胞中ROS 表達(dá)水平升高，分泌LDH 和MDA 增多，SOD 產(chǎn)生減少，細(xì)胞活力下降。正源方預(yù)處理顯著降低了p-p38/p38、p-JNK/JNK 和p-ERK/ERK的表達(dá)水平。可知正源方處理后細(xì)胞中線粒體膜電位升高，細(xì)胞分泌ROS、LDH 及MDA 減少，SOD 增加。基于以上發(fā)現(xiàn)，本文推測(cè)正源方促進(jìn)細(xì)胞存活，抑制HO誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激相關(guān)因子，可能與抑制MAPK 通路的活化有關(guān)。

本研究證實(shí)了正源方對(duì)HO誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷具有保護(hù)作用，并初步探討了正源方的抗氧化損傷作用可能與抑制MAPK 通路的活化有關(guān)。本文不足之處主要有以下三方面：①HO誘導(dǎo)的損傷模型并不能完全模擬輻射引起的損傷，只是具有一定的可比性；② 只初步探索了正源方對(duì)HO誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激指標(biāo)的抑制作用，并且對(duì)MAPK 通路活化的抑制作用，而未深入探究正源方調(diào)控MAPK 通路與氧化應(yīng)激指標(biāo)之間的關(guān)系；③ 未采用陽性對(duì)照藥。在未來研究中，應(yīng)采用輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞和動(dòng)物損傷模型，并選擇合適的陽性對(duì)照藥，進(jìn)一步評(píng)價(jià)正源方抗輻射的作用機(jī)制。以上研究表明，通過HO誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷可初步用來評(píng)價(jià)正源方的抗氧化損傷作用及作用機(jī)制，本研究可為正源方的氧化損傷保護(hù)作用及臨床應(yīng)用提供一定理論參考。