陳 娟， 陳拉斯， 陳 麗， 唐文莊， 張瓊果， 王善志

(海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院， 海南 海口 570000)

急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)是臨床上常見的由多種事件引起的危重急癥，發(fā)病率高，病死率高。在重癥監(jiān)護(hù)病房住院的患者中，大約45～70%的AKI病例是由膿毒癥引起的[1]。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革蘭氏陰性菌的主要外膜成分，是主要的內(nèi)毒素之一[2]。LPS通過誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡，在膿毒癥相關(guān)AKI的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[3]。因此，有必要了解LPS誘導(dǎo)腎小管細(xì)胞損傷的潛在機(jī)制。Forkhead box M1(FOXM1)是一個有翼螺旋/叉頭類轉(zhuǎn)錄因子，是FOX轉(zhuǎn)錄因子家族的一員[4]。研究表明，過表達(dá)FOXM1可改善LPS誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷，促進(jìn)細(xì)胞活力和血管生成，抑制細(xì)胞凋亡和炎癥因子的產(chǎn)生[5]。目前，關(guān)于FOXM1在LPS誘導(dǎo)的腎小管細(xì)胞損傷中的作用及其可能的作用機(jī)制尚不明確。線粒體內(nèi)膜蛋白prohibitin 2(PHB2)是線粒體吞噬作用的受體，調(diào)節(jié)線粒體的多種功能，包括線粒體呼吸修飾、線粒體嵴的維持和有絲分裂激活[6]。目前的證據(jù)顯示，PHB2介導(dǎo)的有絲分裂通過改善線粒體功能障礙和抑制NLRP3炎性小體激活來減輕腎小管上皮細(xì)胞損傷[7]。因此，PHB2可能是治療腎臟疾病的一個有前途的靶點。生物信息學(xué)軟件分析結(jié)果顯示，PHB2啟動子區(qū)域存在FOXM1的潛在結(jié)合靶點。因此，本研究旨在探究FOXM1是否通過調(diào)控PHB2表達(dá)在LPS誘導(dǎo)的腎小管細(xì)胞損傷中發(fā)揮作用，以期為明確LPS誘導(dǎo)腎小管細(xì)胞損傷的潛在機(jī)制及開發(fā)新的膿毒癥相關(guān)AKI治療靶點提供新的科學(xué)資料。

1 材料與方法

1.1主要材料:人近曲小管上皮細(xì)胞HK-2購自武漢普諾賽生命科技有限公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Thermo Fisher Scientific；2×SYBR Green qPCR MasterMix購自北京索萊寶科技有限公司；FOXM1、PHB2和GAPDH抗體購自英國Abcam；CCK-8試劑盒、ATP檢測試劑盒、熒光素酶報告基因檢測試劑盒和增強(qiáng)型線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自翌圣生物科技(上海)股份有限公司；過表達(dá)載體陰性對照(oe-NC)、FOXM1過表達(dá)載體(oe-FOXM1)、shRNA陰性對照(sh-NC)和PHB2特異性shRNA(sh-PHB2)、PHB2的3’-UTR端的野生型(KIF20A-WT)和突變型(KIF20A-MUT)熒光素酶報告質(zhì)粒由金斯瑞生物科技股份有限公司構(gòu)建。

1.2細(xì)胞培養(yǎng):HK-2細(xì)胞用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。細(xì)胞每2天更換一次新鮮培養(yǎng)基，待細(xì)胞覆蓋率達(dá)到80～90%時，胰酶液消化細(xì)胞，進(jìn)行傳代或鋪板操作。

1.3細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染:將對數(shù)期生長的HK-2細(xì)胞接種于6孔板(1×106個/孔)，細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24h后，將細(xì)胞隨機(jī)分為對照組、LPS組、LPS+oe-NC組、LPS+oe-FOXM1組、LPS+oe-NC+sh-NC組、LPS+oe-FOXM1+sh-NC組、LPS+oe-NC+sh-PHB2組、LPS+oe-FOXM1+sh-PHB2組，根據(jù)LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書所示按照分組，分別轉(zhuǎn)染oe-NC、oe-FOXM1、sh-NC和sh-PHB2。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48h后，向細(xì)胞中添加LPS(終濃度1μg/mL)，對照組加入等量溶劑。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24h后，進(jìn)行后續(xù)實驗操作。

1.4qRT-PCR檢測細(xì)胞FOXM1和PHB2 mRNA表達(dá):收集HK-2細(xì)胞，Trizol法提取細(xì)胞的總RNA，隨后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄操作生成cDNA。采用2×SYBR Green qPCR MasterMix進(jìn)行后續(xù)檢測。反應(yīng)程序：95℃、10 min；95℃、15s，60℃、30s，72℃、10s，40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算FOXM1和PHB2 mRNA表達(dá)。qRT-PCR實驗所需引物見表1。

表1 qRT-PCR所需引物序列

1.5Western blot檢測細(xì)胞FOXM1和PHB2蛋白表達(dá):收集HK-2細(xì)胞，RIPA裂解液裂解細(xì)胞后，收集細(xì)胞上清液并測定其蛋白濃度。取30μg樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳和轉(zhuǎn)膜操作。5%脫脂奶粉室溫孵育封閉2h。加入FOXM1抗體(1∶2000)、PHB2抗體(1∶1000)和GAPDH抗體(1∶2000)，于4℃條件下孵育過夜。加入特異性二抗(1∶5000)，室溫條件下孵育1h后，凝膠成像系統(tǒng)檢測蛋白條帶。Image J軟件分析各蛋白條帶的灰度值。

1.6CCK-8檢測細(xì)胞活力:將對數(shù)期生長的HK-2細(xì)胞接種于96孔板(1×104個/孔)，按照1.3所示進(jìn)行分組處理，另設(shè)置空白組(未接種細(xì)胞)用作讀值調(diào)零。隨后按照CCK-8試劑盒說明書所示，酶標(biāo)儀檢測各孔細(xì)胞在450nm處的光密度(OD)值。細(xì)胞活力(%)=(實驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%或者是細(xì)胞活力(%)=(實驗組OD值-空白組OD值)/(LPS+oe-NC+sh-NC組OD值-空白組OD值)×100%。

1.7流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡:收集HK-2細(xì)胞，預(yù)冷PBS清洗細(xì)胞3次。重新收集細(xì)胞，向細(xì)胞中加入1×Binding Buffer重懸細(xì)胞沉淀，并將細(xì)胞密度調(diào)整為1×106個/mL。取100μL細(xì)胞懸液置于新的離心管內(nèi)，加入5μL FITC-Annexin V和5μL PI工作液，充分混勻后，室溫條件下避光孵育15min。向細(xì)胞中加入400μL 1×Binding Buffer，充分混勻后，立即用流式細(xì)胞儀檢測。

1.8JC-1染色檢測線粒體膜電位:棄去HK-2細(xì)胞培養(yǎng)基，PBS清洗細(xì)胞后，加入1mL新鮮培養(yǎng)基。向細(xì)胞中加入JC-1染色工作液，37℃培養(yǎng)箱中孵育20min，棄去上清液，JC-1染色緩沖液清洗細(xì)胞2次后，加入培養(yǎng)基，熒光顯微鏡下觀察并拍照。Image J軟件測量熒光強(qiáng)度，通過紅綠熒光的比例來衡量線粒體去極化的比例。

1.9試劑盒檢測細(xì)胞ATP含量:收集HK-2細(xì)胞，按照ATP檢測試劑盒說明書所示檢測各組細(xì)胞中ATP含量。

1.10熒光素酶報告實驗檢測FOXM1和PHB2的靶向結(jié)合:通過Consite(http://consite.genereg.net/)和JASPAR(http://jaspar.binf.ku.dk/)軟件分析預(yù)測FOXM1和PHB2的轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點，分別構(gòu)建針對PHB2預(yù)測結(jié)合位點的野生型(PHB2-WT)和突變型(PHB2-MUT)熒光素酶報告質(zhì)粒。分別將PHB2-WT+oe-NC、PHB2-MUT+oe-NC、PHB2-WT+oe-FOXM1和PHB2-MUT+oe-FOXM1轉(zhuǎn)染至HK-2細(xì)胞中。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48h后，根據(jù)熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書所示，檢測熒光素酶活性。

1.11ChIP-PCR實驗檢測FOXM1對PHB2啟動子調(diào)控作用:收集HK-2細(xì)胞，加入甲醛固定細(xì)胞后，超聲破碎細(xì)胞，獲得200bp～1000bp的染色質(zhì)片段，離心收集細(xì)胞上清液。應(yīng)用FOXM1抗體，按照SimpleChIP?Plus Sonication Chromatin IP試劑盒說明書進(jìn)行后續(xù)實驗操作，將與FOXM1蛋白結(jié)合的DNA序列分離出來。以該DNA片段作為qRT-PCR實驗中的模板，以檢測PHB2的轉(zhuǎn)錄富集。

2 結(jié) 果

2.1LPS對腎小管上皮細(xì)胞中FOXM1表達(dá)的影響:與對照組相比，LPS組細(xì)胞中FOXM1 mRNA和蛋白表達(dá)均明顯降低(P<0.05)，結(jié)果見圖1。

圖1 LPS對腎小管上皮細(xì)胞中FOXM1表達(dá)的影響

2.2過表達(dá)FOXM1對LPS誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷的影響:與對照組相比，LPS組細(xì)胞中FOXM1 mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)，細(xì)胞活力明顯降低(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)；與LPS組比較，LPS+oe-NC組細(xì)胞中FOXM1 mRNA和蛋白表達(dá)、細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與LPS+oe-NC組相比，LPS+oe-FOXM1組細(xì)胞中FOXM1 mRNA和蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)，細(xì)胞活力明顯升高(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05)。見圖2和圖3。

圖2 各組細(xì)胞中FOXM1 mRNA和蛋白表達(dá)

圖3 過表達(dá)FOXM1對LPS誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷的影響

2.3過表達(dá)FOXM1對LPS誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞線粒體功能障礙的影響:與對照組相比，LPS組細(xì)胞紅/綠熒光強(qiáng)度比值和ATP含量明顯降低(P<0.05)；與LPS組比較，LPS+oe-NC組細(xì)胞紅/綠熒光強(qiáng)度比值和ATP含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與LPS+oe-NC組相比，LPS+oe-FOXM1組細(xì)胞紅/綠熒光強(qiáng)度比值和ATP含量明顯升高(P<0.05)。見圖4。

圖4 過表達(dá)FOXM1對LPS誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞線粒體功能障礙的影響

2.4FOXM1對細(xì)胞PHB2表達(dá)的影響:與對照組相比，LPS組細(xì)胞中PHB2 mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)；與LPS組比較，LPS+oe-NC組細(xì)胞中PHB2 mRNA和蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與LPS+oe-NC組相比，LPS+oe-FOXM1組細(xì)胞中PHB2 mRNA和蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)。與oe-NC組相比，oe-FOXM1組細(xì)胞中PHB2-WT相對熒光素酶活性明顯升高(P<0.05)，PHB2啟動子區(qū)明顯富集(P<0.05)。見圖5。

圖5 FOXM1對細(xì)胞PHB2表達(dá)的影響

2.5FOXM1/PHB2軸對LPS誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷的影響:與LPS+oe-NC+sh-NC組相比，LPS+oe-FOXM1+sh-NC組細(xì)胞中FOXM1和PHB2蛋白表達(dá)、細(xì)胞活力明顯升高(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05)；與LPS+oe-NC+sh-NC組相比，LPS+oe-NC+sh-PHB2組細(xì)胞中PHB2蛋白表達(dá)和細(xì)胞活力明顯降低(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)，F(xiàn)OXM1蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與LPS+oe-FOXM1+sh-NC組相比，LPS+oe-FOXM1+sh-PHB2組細(xì)胞中FOXM1蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，PHB2蛋白表達(dá)和細(xì)胞活力明顯降低(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)。見圖6和圖7。

圖6 各組細(xì)胞中FOXM1和PHB2蛋白表達(dá)

圖7 FOXM1/PHB2軸對LPS誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷的影響

2.6FOXM1/PHB2軸對LPS誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞線粒體功能障礙的影響:與LPS+oe-NC+sh-NC組相比，LPS+oe-FOXM1+sh-NC組細(xì)胞紅/綠熒光強(qiáng)度比值和ATP含量明顯升高(P<0.05)；與LPS+oe-NC+sh-NC組相比，LPS+oe-NC+sh-PHB2組細(xì)胞紅/綠熒光強(qiáng)度比值和ATP含量明顯降低(P<0.05)；與LPS+oe-FOXM1+sh-NC組相比，LPS+oe-FOXM1+sh-PHB2組細(xì)胞中紅/綠熒光強(qiáng)度比值和ATP含量明顯降低(P<0.05)。見圖8。

圖8 FOXM1/PHB2軸對LPS誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞線粒體功能障礙的影響

3 討 論

膿毒癥所致AKI的腎臟病理特征包括腎實質(zhì)嚴(yán)重炎癥、腎小球內(nèi)血栓形成、內(nèi)皮功能障礙和嚴(yán)重的腎小管損傷[8]。腎小管損傷是LPS誘導(dǎo)的AKI的一個顯著特征，其特征是細(xì)胞脫落、空泡化和刷狀邊緣消失。因此，有必要繼續(xù)探究LPS誘導(dǎo)腎小管損傷的具體機(jī)制，這對于開發(fā)新的治療靶點以改善膿毒癥所致AKI具有重要作用。

線粒體在病理生理過程中都有重要作用，調(diào)節(jié)鈣穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞信號通路、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和細(xì)胞凋亡等過程[9]。心臟和腎臟擁有最豐富的線粒體，它們協(xié)同工作來提供能量[10]。線粒體功能障礙的多個方面，如三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)的耗竭、線粒體膜電位的破壞以及細(xì)胞凋亡的加劇，被認(rèn)為是影響膿毒癥AKI的因素[11]。因此，改善線粒體功能障礙是膿毒癥AKI潛在的預(yù)防和治療策略。FOXM1是一種增殖特異性轉(zhuǎn)錄因子，主要表達(dá)于高周期器官，如睪丸和胸腺。在發(fā)育過程中，它也會在不同的器官中表達(dá)，包括腎臟和各種類型的癌癥。目前，已有證據(jù)顯示，F(xiàn)OXM1參與了線粒體功能的調(diào)節(jié)，F(xiàn)OXM1可通過促進(jìn)有絲分裂來改善細(xì)胞線粒體功能障礙[12]。FOXM1在組織損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用，如FOXM1可促進(jìn)急性缺血性腎損傷修復(fù)過程中近端小管增殖。敲低FOXM1會導(dǎo)致細(xì)胞增殖減少，并下調(diào)參與細(xì)胞周期的下游靶基因的表達(dá)[13]；此外，下調(diào)FOXM1表達(dá)可抑制促增殖因子的產(chǎn)生和細(xì)胞增殖，并減少腎缺血/再灌注誘導(dǎo)的AKI小鼠腎小管的再生[14]。本研究結(jié)果顯示，LPS可抑制HK-2細(xì)胞活力、線粒體膜電位和ATP產(chǎn)生，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。過表達(dá)FOXM1可促進(jìn)LPS處理的HK-2細(xì)胞活力、線粒體膜電位和ATP產(chǎn)生，抑制細(xì)胞凋亡。該研究結(jié)果顯示，F(xiàn)OXM1可在LPS誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞損傷中發(fā)揮保護(hù)作用。

PHB2是一種高度保守的蛋白，參與調(diào)控轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期、細(xì)胞表面信號傳遞、細(xì)胞衰老、細(xì)胞凋亡、姐妹染色單體凝聚以及線粒體的多效性[15]。PHB2通過其多樣的生物學(xué)功能，在多種疾病中發(fā)揮保護(hù)作用，如PHB2在線粒體功能維持方面具有重要作用。敲低PHB2可抑制腎小管上皮細(xì)胞線粒體遺傳完整性和線粒體呼吸，導(dǎo)致線粒體氧化應(yīng)激和線粒體凋亡，從而促進(jìn)AKI疾病進(jìn)程；蛛網(wǎng)膜下腔出血呈時間依賴性抑制大鼠腦組織中PHB2表達(dá)[16]。抑制PHB2表達(dá)可明顯促進(jìn)氧化應(yīng)激相關(guān)神經(jīng)元細(xì)胞死亡和神經(jīng)損傷，從而促進(jìn)蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦損傷；小鼠足細(xì)胞中PHB2的缺失可導(dǎo)致小鼠腎臟線粒體結(jié)構(gòu)缺陷、進(jìn)行性蛋白尿、腎衰竭和動物死亡。目前已有證據(jù)顯示，PHB2通過改善線粒體功能障礙來減輕血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷[7]。關(guān)于PHB2在LPS誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞中的作用尚不明確。本研究結(jié)果顯示，敲低PHB2可抑制LPS處理的HK-2細(xì)胞活力、線粒體膜電位和ATP產(chǎn)生，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。此外，F(xiàn)OXM1可靶向結(jié)合PHB2啟動子區(qū)域，促進(jìn)PHB2表達(dá)。進(jìn)一步實驗結(jié)果顯示，敲低PHB2可部分逆轉(zhuǎn)過表達(dá)FOXM1對LPS處理的HK-2細(xì)胞的作用，導(dǎo)致HK-2細(xì)胞活力、線粒體膜電位和ATP產(chǎn)生降低，細(xì)胞凋亡率升高。該研究結(jié)果表明，F(xiàn)OXM1可通過促進(jìn)PHB2轉(zhuǎn)錄在LPS誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞損傷中發(fā)揮保護(hù)作用。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)OXM1可通過促進(jìn)PHB2轉(zhuǎn)錄來上調(diào)PHB2的表達(dá)，促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞活力、線粒體膜電位和ATP產(chǎn)生，抑制細(xì)胞凋亡，從而在LPS誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞損傷中發(fā)揮保護(hù)作用。該研究結(jié)果為明確LPS誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞損傷的分子機(jī)制及開發(fā)新的治療靶點提供了新的科學(xué)資料。