梁倩欣 董家銘 謝曼琳 鄒艷芳 涂興明,2 趙可偉,2*

1.廣州中醫(yī)藥大學，廣東 廣州 510006

2.廣州中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510378

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是一種骨量低下，骨組織微結構損壞，導致骨脆性增加的疾病[1]。隨著世界人口的老齡化，OP發(fā)病率逐年上升，骨折是其導致的嚴重后果，給人民的健康帶來巨大傷害。目前臨床上治療OP的藥物以鈣劑和雌激素類藥物等為主，具有一定的臨床療效但有副作用不宜長期服用[2]。而中藥具有良好的臨床診療效果，并且其來源廣泛、成本低廉和不良反應較小，實驗研究也表明中藥可提高骨密度，緩解疼痛等癥狀，在治療OP方面具有獨特的優(yōu)勢。

方劑是由多種中藥組成，具有多成分、多靶點的特點，不同中藥的配伍有著不同的功效，目前大多數(shù)的研究方法仍是選取某個中藥或成分進行研究，不能精準解釋方劑發(fā)揮療效的物質基礎及組方規(guī)律等問題[3]，而網(wǎng)絡藥理學的出現(xiàn)，可作為疾病與中藥方劑之間的橋梁，整體、系統(tǒng)地對方劑進行研究。方劑配伍組成的基本原則是君臣佐使，因此君臣佐使各藥物的配伍決定方劑治療及作用的方向。我院經(jīng)驗方骨康方，在臨床上可顯著緩解OP患者腰腿痛及腎陽虛癥狀，并且已有研究[4]證明骨康方具有抑制骨吸收和促進骨形成的雙重作用。骨康方中君藥(補骨脂)、臣藥(淫羊藿、肉蓯蓉、熟地黃、菟絲子和白芍)、佐藥(黃芪、丹參和當歸)和使藥(大棗)，據(jù)文獻檢索可知已有部分單味藥的機制研究，但骨康方藥整體的靶點機制異同并未進行系統(tǒng)研究。因此，本研究主要通過網(wǎng)絡藥理學來探討骨康方藥治療OP相關靶點及通路的異同，為深入研究骨康方中君臣佐使各藥組成的具體意義奠定堅實的基礎，同時也可為尋找骨康方的最佳組成提供參考的方向。

1 材料和方法

1.1 藥物活性成分及潛在靶點的篩選

通過中藥綜合數(shù)據(jù)庫(TCMID)獲得骨康方君藥(補骨脂)的成分，使用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP)篩選其活性成分及其靶點(OB≥30%、DL≥0.18)；在TCMSP以相同條件分別篩選臣藥(淫羊藿、肉蓯蓉、熟地黃、菟絲子和白芍)、佐藥(黃芪、丹參和當歸)和使藥(大棗)的活性成分及其靶點；同時，通過文獻檢索補充不在篩選納入范圍內但已有研究表明對OP有明確療效的活性成分及靶點。通過uniprot (2020年8月3日更新)進行Gene symbol的轉化，刪除非人類及無數(shù)據(jù)靶點。使用Cytoscape軟件構建活性成分-潛在靶點網(wǎng)絡。

1.2 OP靶點的獲取

分別在OMIM(2020年9月15日更新)、 TTD (2020年6月1日更新)以及DisGeNET (version:7.0)數(shù)據(jù)庫檢索疾病關鍵詞“Osteoporosis”，得到相應的靶點，匯總三個數(shù)據(jù)庫的靶點，去除重復靶點，得到OP靶點數(shù)據(jù)集。

1.3 中藥-疾病交集靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡(PPI)的構建

通過Venny 2.1將中藥靶點和疾病靶點進行比對，分別篩選君藥-OP交集靶點、臣藥-OP交集靶點、佐藥-OP交集靶點和使藥-OP交集靶點。利用STRING(version 11.0)分析交集基因間的相互作用，設置置信度>0.9并隱藏游離單結點，分別構建交集靶點之間的PPI。

1.4 中藥-疾病關鍵靶點的KEGG通路富集分析

將PPI導入Cytoscape，分別以degree、closeness和betweenness分析PPI網(wǎng)絡，取其大于或等于中位數(shù)部分的交集，即為中藥-疾病的關鍵靶點，其中君藥的關鍵靶點不做篩選。使用David(version:6.8)對君臣佐使的關鍵靶點進行KEGG 通路分析，去除非骨相關的具體疾病名稱相關通路，使用Venny 2.1軟件對關鍵靶點的KEGG通路結果進行交集。取P<0.05為顯著富集的閾值，在R語言中使用ggplot2軟件進行處理。結果按P值大小順序排列，取前24的結果，氣泡大小代表通路的基因數(shù)量，P值代表富集的顯著程度。

2 結果

2.1 骨康方中藥的活性成分及作用靶點

通過數(shù)據(jù)庫和文獻檢索分別篩選得到君藥的活性成分4個，潛在靶點40個；臣藥的成分40個，靶點254個；佐藥的成分75個，靶點242個；使藥的成分19個，靶點202個。見圖1。

2.2 骨康方中藥-OP的交集靶點

通過數(shù)據(jù)庫對OP進行檢索，其中OMIM數(shù)據(jù)庫檢索獲得42個OP靶點，TTD數(shù)據(jù)庫34個，DisGeNET數(shù)據(jù)庫1 098個，匯總去重后共得到OP靶點1 152個。分別將骨康方中藥的潛在靶點與OP靶點進行交集，獲得君藥-OP的交集靶點12個、臣藥87個、佐藥86個、使藥80個。結果見圖2。

2.3 骨康方中藥-OP交集靶點的PPI網(wǎng)絡

君藥-OP交集靶點的PPI網(wǎng)絡，具有6節(jié)點、8個作用關聯(lián)；臣藥-OP交集靶點的PPI網(wǎng)絡，具有78節(jié)點、288個作用關聯(lián)；佐藥-OP交集靶點的PPI網(wǎng)絡，具有76節(jié)點、328個作用關聯(lián)；使藥-OP交集靶點的PPI網(wǎng)絡，具有72節(jié)點、258個作用關聯(lián)。見圖3。

2.4 骨康方中藥-OP關鍵靶點的KEGG通路富集分析

利用Cytoscape軟件獲得君藥-OP關鍵靶點有6個、臣藥有30個、佐藥有31個和使藥有30個，結果按degree大小順序排列，見表1。然后分別對關鍵靶點進行KEGG通路富集分析，結果見圖4。將君臣佐使各藥關鍵靶點的KEGG通路結果進行交集后發(fā)現(xiàn)共同通路有9條、君藥特有的通路有7條、臣藥有2條和使藥有1條，而佐藥無特有的通路。結果見表2、圖5。

表2 KEGG通路交集結果Table 2 Intersection results of KEGG pathway

3 討論

本研究通過網(wǎng)絡藥理學對骨康方中君臣佐使各藥的具體靶點及通路進行探討，以對比君臣佐使各藥對OP具體作用的異同，試圖通過中藥分子作用機制解釋君臣佐使組成及配伍的具體意義。通過構建不同交集靶點的PPI網(wǎng)絡后分別篩選出關鍵靶點，發(fā)現(xiàn)君藥的部分關鍵靶點在臣佐使藥中也分別存在，說明臣佐使藥可能通過這些共同的關鍵靶點輔佐君藥發(fā)揮其主要的作用治療OP，同時我們對關鍵靶點進行degree排序后發(fā)現(xiàn)君臣佐使的共同關鍵靶點排序有所不同，那么君臣佐使各藥可能治療OP的側重點有所不同，符合君臣佐使在方劑中負責的部分不同。

本研究通過對骨康方中君臣佐使各藥關鍵靶點的KEGG通路結果進行交集，發(fā)現(xiàn)一共有9條通路為君臣佐使各藥的共同通路，其中雌激素信號通路與OP過程密切相關，有研究表明部分中藥具有類雌激素作用，可通過雌激素受體作用于相關的骨代謝過程進而影響OP的進程[5]；其他的共同通路雖與OP沒有直接的關系，但通過KEGG官網(wǎng)對共同通路進行搜索發(fā)現(xiàn)，它們大多參與細胞生長、死亡及環(huán)境[6-7]、調控激素影響內分泌系統(tǒng)及生長發(fā)育[8]以及調節(jié)鈣離子[9]等，特別值得注意的是這些通路與MAPK通路有聯(lián)系，而文獻檢索顯示MAPK通路可調控成骨細胞的增殖分化[10]，雌激素受體信號通路在MAPK信號通路的上游[11]，所以推測骨康方的君臣佐使各藥可能通過MAPK通路對OP進行調控。同時交集結果顯示君藥有7條獨特的通路、臣藥有2條、使藥有2條，而佐藥無自己獨特的通路。其中君藥的7條通路與Ca離子信號通路有關[12-13]，鈣是構成骨骼的重要物質[14]，對鈣離子通路的調控可影響骨代謝過程，有研究表明左歸丸可通過上調腎鈣和骨鈣轉運通路中相關蛋白的表達來發(fā)揮抗OP的作用[15]，那么君藥可能通過調節(jié)鈣離子通路促進骨形成從而影響OP的進展。臣藥的2條獨特通路主要與免疫調節(jié)的相關通路有關[16]，淋巴細胞的部分增殖分化過程在骨髓內進行，與骨髓造血共享同一個微環(huán)境，可共享微環(huán)境中的各種物質，所以免疫因子、通路的變化可影響共享的微環(huán)境，從而影響骨細胞的相關過程[17]。使藥的1條獨特通路與細胞間粘附連接過程有關，這過程對維持組織結構和細胞極性非常重要，并且可以限制細胞的移動和增殖[18]。綜上，君臣佐使各藥具有獨特的通路，并且它們影響的細胞過程也不同。君藥主要集中于鈣離子通路，可能通過鈣離子通路促進骨形成，從而緩解OP的主要癥狀——疼痛；臣藥主要與免疫微環(huán)境相關，可能通過調節(jié)免疫微環(huán)境間接影響骨代謝過程，從而輔助君藥緩解疼痛的癥狀；而使藥則是對基礎的細胞過程起作用，起到調和諸藥的作用，符合君臣佐使的相關理論。

綜上所述，骨康方的君臣佐使各藥有共同的作用靶點及相關的通路，證明了它們作用時密切相關、相互輔佐，可能通過MAPK通路共同完成對OP的治療作用，與此同時，它們又各自具有一定治療特點的靶點及通路，發(fā)揮自己獨特的作用。