馬騰 陳德強(qiáng) 王衛(wèi)國

1.山東中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355

2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院骨科，山東 濟(jì)南 250355

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)作為一種全身性骨代謝疾病，以單位骨量減少為特征，伴隨骨微觀結(jié)構(gòu)的退化，參與因素復(fù)雜多樣[1]，國內(nèi)調(diào)查研究證實(shí)全國范圍內(nèi)OP的總患病率約為6.6%～19.3%，且隨著我國老齡化趨勢(shì)漸顯，預(yù)計(jì)未來30年國內(nèi)OP患者人數(shù)將高達(dá)2.12億[2]。甲狀腺功能亢進(jìn)癥(hyperthyroidism)是發(fā)生骨質(zhì)疏松的重要因素之一[3]，兩者作為兩種臨床常見內(nèi)分泌疾病，關(guān)系密切。一項(xiàng)納入114例觀察對(duì)象的對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，甲亢組患者骨密度下降幅度和血清骨代謝指標(biāo)提升程度均較為顯著[4]。

甲狀腺相關(guān)激素水平對(duì)骨組織的影響早已被學(xué)者們所認(rèn)識(shí)[5]，其中甲狀腺素(thyroid hormones，TH)、促甲狀腺素(thyroid stimulating hormone，TSH)等對(duì)骨骼發(fā)育均存在正向調(diào)控、維持作用[6-7]。但甲亢患者TH水平過高則會(huì)導(dǎo)致骨轉(zhuǎn)換速率升高，骨吸收和骨形成過程的比例失衡[8]，同時(shí)TSH水平受到抑制也會(huì)影響其發(fā)揮骨調(diào)節(jié)作用，這些因素都會(huì)對(duì)甲亢患者的骨密度產(chǎn)生負(fù)面作用。本研究在臨床試驗(yàn)的基礎(chǔ)上應(yīng)用生物信息學(xué)整合OP及甲亢的基因數(shù)據(jù)，不僅能較為科學(xué)地從分子層面闡述二者間的互作機(jī)制，而且也為藥物同時(shí)干預(yù)兩種疾病提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 臨床資料

1.1.1一般資料：隨機(jī)選取2018年10月至2020年10月于山東省中醫(yī)院就診的40例甲亢女性患者為觀察組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合甲亢的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②年齡為45～75歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并嚴(yán)重心、腦等疾??；②合并其他影響骨密度的內(nèi)分泌疾病；③嚴(yán)重的意識(shí)及溝通障礙。最終觀察組患者平均年齡為(60.1±7.5)歲。隨機(jī)選取同期于我院就診的甲狀腺功能正常女性40例為對(duì)照組，年齡45～75歲，平均(60.1±6.0)歲。

1.1.2檢測(cè)指標(biāo)：以法國MEDI雙能X線骨密度儀分別檢測(cè)兩組受試者右側(cè)髖關(guān)節(jié)、腰椎(L1～4)、右側(cè)前臂，得到受試者的骨密度和T值。

1.2 骨質(zhì)疏松-甲亢靶點(diǎn)篩選、映射與PPI分析

分別在三大人類疾病數(shù)據(jù)庫(GeneCards、TTD、OMIM)中篩選OP與甲亢的相關(guān)靶點(diǎn)[9-11]。其中GeneCards數(shù)據(jù)庫中選擇相關(guān)性Score值前300的靶基因。隨后將兩組基因分別通過Uniprot數(shù)據(jù)庫轉(zhuǎn)換成Uniprot ID篩選已認(rèn)證靶點(diǎn)同時(shí)合并去重。映射兩組靶點(diǎn)并將其交集上傳至STRING v11.0平臺(tái)構(gòu)建蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)[12]。運(yùn)用Cytoscape 3.7.2平臺(tái)的Network Analyzer篩選PPI網(wǎng)絡(luò)連接度(degree)>10的靶點(diǎn)制作核心靶點(diǎn)圖。

1.3 骨質(zhì)疏松-甲亢的GO分析和KEGG通路分析

借助Metascape數(shù)據(jù)庫[13]將靶點(diǎn)以P< 0.01、富集因子(enrichment factor)>1.5的設(shè)置分別進(jìn)行GO(Gene Ontology)分析以及 KEGG (Kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路分析，用OmicShare平臺(tái)將數(shù)據(jù)可視化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 臨床觀察指標(biāo)

組間比較結(jié)果顯示，觀察組的T值及骨密度均低于對(duì)照組(P<0.01)，見表1。

表1 兩組樣本骨密度及T值比較Table 1 Comparison of bone mineral density and T-score between the two

2.2 骨質(zhì)疏松-甲亢的靶點(diǎn)篩選分析結(jié)果

三大基因庫所得靶點(diǎn)經(jīng)過Uniprot篩選整合后共獲得295個(gè)OP相關(guān)靶基因和291個(gè)甲亢相關(guān)靶基因。80個(gè)交集靶點(diǎn)制作韋恩圖及PPI網(wǎng)絡(luò)(見圖1、圖2)。篩選到核心靶點(diǎn)12個(gè)(見圖3)。經(jīng)Metascape數(shù)據(jù)庫分析，據(jù)P值制作前15項(xiàng)生物學(xué)過程聚類群的最具代表性過程和前8條KEGG通路聚類群的最具代表性通路圖(見圖4、圖5)。生物過程及通路下所含靶點(diǎn)分別見表2、表3。

表2 GO富集分析所含靶基因(前15條)Table 2 Target genes contained in GO enrichment analysis (top 15)

表3 KEGG通路下所含靶基因(前8條)Table 3 Target genes contained in KEGG pathway (top 8)

3 討論

TH能夠通過骨骼細(xì)胞TH受體(TR-α)調(diào)節(jié)骨重塑，一方面三碘甲狀腺原氨酸(T3)可以調(diào)節(jié)胰島素樣生長因子(IGF)等促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化，另一方面T3又能促進(jìn)成骨細(xì)胞-破骨細(xì)胞偶聯(lián)激活，并誘導(dǎo)IL6等細(xì)胞因子參與破骨細(xì)胞的活化[14-15]，甲亢性骨質(zhì)疏松是因TH過多引起機(jī)體骨代謝及骨礦化紊亂而導(dǎo)致的繼發(fā)性疾病。本研究通過臨床試驗(yàn)結(jié)合生物信息學(xué)映射OP與甲亢的核心交集靶點(diǎn)及作用通路，以求進(jìn)一步預(yù)測(cè)兩病的共同發(fā)病機(jī)制，探討兩病發(fā)病過程中的相互關(guān)系。

有分析表明甲亢患者相關(guān)細(xì)胞因子如IL-6、IL-10、TNF-α等水平顯著升高，且與骨密度呈負(fù)相關(guān)性[16]，而這些細(xì)胞因子被證明可以通過影響免疫應(yīng)答反應(yīng)來調(diào)節(jié)甲狀腺功能，從而推動(dòng)甲亢的發(fā)生[17]；同樣這些細(xì)胞因子也通過參與不同的調(diào)節(jié)機(jī)制而對(duì)OP產(chǎn)生影響[18]，其中TNF-α和IL6可以上調(diào)破骨細(xì)胞水平并抑制骨保護(hù)素(OPG)的合成[19]，IL-10的表達(dá)則能夠?qū)ζ乒羌?xì)胞活性起到抑制作用[20]。這提示IL-6、TNF-α等基因的表達(dá)上調(diào)可能是兩病的共同發(fā)病機(jī)制之一。甲亢患者常因TH水平異常而影響糖代謝過程，其亢進(jìn)狀態(tài)的機(jī)體代謝對(duì)胰島素(Insulin，INS)的需求量明顯增高[21]。國內(nèi)有臨床研究顯示INS的應(yīng)用能夠?qū)ρ撬降姆€(wěn)定和甲亢癥狀的緩解起到正向調(diào)節(jié)作用[22]，Wang等[23]發(fā)現(xiàn)葡萄糖濃度與成骨細(xì)胞的凋亡速率呈正相關(guān)，因此甲亢患者機(jī)體INS水平下調(diào)進(jìn)而導(dǎo)致的血糖水平異常，也可能成為繼發(fā)OP的重要機(jī)制之一。過高的TH水平同樣會(huì)影響人體內(nèi)蛋白質(zhì)的代謝速率[24]，導(dǎo)致甲亢患者常因白蛋白(Albumin，ALB)水平降低而加重營養(yǎng)不良表現(xiàn)。ALB水平過低與OP是否存在相關(guān)性至今仍存在爭議[25]，但有研究[26]表明低蛋白血癥可以從調(diào)節(jié)激素水平、骨代謝和轉(zhuǎn)錄翻譯等方面推動(dòng)OP的形成。

IL-6等細(xì)胞因子能夠通過JaK-STAT信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)骨代謝和甲狀腺激素水平，Song等[27]研究表明諸多炎癥細(xì)胞因子在伴有甲亢的Graves眼病患者中表達(dá)活躍，且與細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、JaK-STAT等通路密切相關(guān)；于雪冰等[28]發(fā)現(xiàn)不同的細(xì)胞因子激活JaK-STAT通路，能分別上調(diào)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的分化水平。PI3K-Akt信號(hào)通路因其調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞關(guān)系的作用，被認(rèn)為是維持骨組織穩(wěn)態(tài)的重要通路之一[29]。國內(nèi)有研究[30]通過對(duì)補(bǔ)腎固本方研究發(fā)現(xiàn)抑制PI3K/AKT/m TOR信號(hào)通路表達(dá)，可以保護(hù)骨小梁結(jié)構(gòu)，下調(diào)破骨細(xì)胞分化；同樣PI3K/AKT信號(hào)通路與Graves病雌鼠的甲狀腺組織病理狀態(tài)和氧化應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)節(jié)亦被證明有一定相關(guān)性[31]。胰島素可以通過I型糖尿病信號(hào)通路等涉及糖代謝的通路參與調(diào)節(jié)甲亢和骨質(zhì)疏松的發(fā)生發(fā)展過程[21-23]。有研究[32-33]顯示HIF-1信號(hào)通路的活性水平與骨質(zhì)疏松有明顯的相關(guān)性，而該通路的活性通常被缺氧誘導(dǎo)因子亞基HIF-1α的蛋白水平直接決定。HIF-1α在調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞增殖、破骨細(xì)胞活性、VEGF等血管內(nèi)皮生長因子水平等方面均參與作用[34]；樊麗婭等[35]報(bào)道甲亢患者的HIF-1α水平與其TH水平呈正相關(guān)，這提示甲亢與骨質(zhì)疏松可能通過HIF-1信號(hào)通路而產(chǎn)生直接聯(lián)系。脂肪細(xì)胞因子同樣能夠直接或間接的影響兩病進(jìn)程，研究[36]表明瘦素(Leptin，LEP)有參與調(diào)節(jié)機(jī)體下丘腦-垂體-甲狀腺軸的功能，從而與甲狀腺激素水平存在相關(guān)性；而瘦素同樣被認(rèn)為能因其代謝失衡而導(dǎo)致骨代的謝紊亂[37]。但無論是關(guān)于甲亢時(shí)瘦素水平的研究，還是瘦素對(duì)骨代謝具體影響的研究，都未能得出一個(gè)統(tǒng)一明確的結(jié)論[38-39]，這需要今后更進(jìn)一步的研究。

綜上所述，OP和甲亢的相互發(fā)病機(jī)制可能與IL6、TNF、INS、ALB、IGFBP3等基因的上下調(diào)表達(dá)密切相關(guān)，而兩病之間相互作用的信號(hào)通路主要涉及炎癥因子、糖代謝、缺氧、脂肪細(xì)胞等方面。本研究在臨床試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，依靠生物信息學(xué)探索并可視化骨質(zhì)疏松與甲亢的關(guān)聯(lián)靶點(diǎn)及信號(hào)通路，能夠更加清晰的表達(dá)兩者的互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，還可以為藥物同時(shí)調(diào)控兩種疾病提示潛在靶點(diǎn)。當(dāng)然，這種基因靶點(diǎn)的信息整合受限于生物信息技術(shù)的發(fā)展水平及疾病數(shù)據(jù)庫的時(shí)效性，同時(shí)對(duì)于基因表達(dá)量及激活程度等也需隨數(shù)據(jù)完善而進(jìn)一步研究。