楊一秋 李蘭 解繼勝 陳建海 羅秀秀 毛寶玉 趙娜 周蘭島

1.右江民族醫(yī)學(xué)院，廣西 百色 533000

2.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，廣西 百色 533000

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種常見的以骨量降低、骨微結(jié)構(gòu)破壞為特征的代謝性骨骼疾病[1-2]。常見的骨質(zhì)疏松癥包括原發(fā)性和繼發(fā)性。原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥常發(fā)生在絕經(jīng)后婦女，主要表現(xiàn)為破骨細(xì)胞活性升高而成骨細(xì)胞活性未升高，最終使得溶骨效應(yīng)增強(qiáng)，從而出現(xiàn)骨質(zhì)疏松癥[3]。對于骨質(zhì)疏松癥的診斷和治療已經(jīng)有所好轉(zhuǎn)但與糖尿病管理相比仍然不足，需要進(jìn)一步的努力來改善[4]。目前公認(rèn)的治療方法是雌激素替代療法(HRT)，但長期應(yīng)用HTR會增加老年女性患子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、血栓栓塞性疾病的風(fēng)險(xiǎn)[5]。葛根的主要活性成分之一葛根素可以改善心腦血管疾病、起到保護(hù)神經(jīng)和預(yù)防治療骨質(zhì)疏松癥的作用[6]。傅光濤等[7]研究發(fā)現(xiàn)12周是使用卵巢切除法建立雌性C57/BL6J成年小鼠絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型的合適時(shí)機(jī)，這與我們之前的研究結(jié)果一致[8]。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型的成功建立，為本研究的順利開展提供了很好的幫助。因此，本研究主要探討葛根素對去卵巢小鼠骨組織形態(tài)的影響以及其可能的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)動物：10～12 周齡，體重約 20～25 g的雌性C57BL/6小鼠(SPF級)，購于長沙市天勤生物技術(shù)有限公司。所有實(shí)驗(yàn)用小鼠均符合相關(guān)動物倫理審批要求[SCXK(湘)2019-0014]，實(shí)驗(yàn)流程嚴(yán)格遵守動物實(shí)驗(yàn)中心的要求和使用指南。實(shí)驗(yàn)前購買的小鼠統(tǒng)一放在動物實(shí)驗(yàn)中心檢疫室飼養(yǎng)7 d，然后轉(zhuǎn)移到SPF級實(shí)驗(yàn)室。小鼠飼養(yǎng)環(huán)境保持室溫在24～26 ℃，濕度為55%～60%。

實(shí)驗(yàn)試劑：75%酒精、戊巴比妥鈉、生理鹽水、葛根素(成都埃法 3681-99-0)、EASYspin Plus骨組織RNA快速提取試劑盒、2× SYBR Mixture 熒光定量試劑盒(北京天根(Cat# FP-205-2)、PTEN抗體(稀釋比例1：90 Cat:AF6351 Affinity)、catalase抗體(稀釋比例1：90 Cat：DF7545 Affinity)、P-AKT(稀釋比例1∶90 Cat：AF0016 Affinity)、山羊抗兔Ig二抗(Cat：PV-6001 北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)、DAB顯色試劑盒(Cat：ZLI-9019北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)、蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒(C0105，碧云天)；熒光倒置顯微鏡(2015236500，Leica DMI3000B)。

1.2 方法

1.2.1建立去卵巢小鼠模型：將動物隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham)、去卵巢組(Ovx)、葛根素組(Pue)。取3%的戊巴比妥鈉(40 mg/kg)，注射小鼠，待小鼠行動遲緩進(jìn)入麻醉狀態(tài)后，采用75%酒精局部消毒，從小鼠兩側(cè)背部縱向切開進(jìn)入腹腔，找到兩側(cè)粉紅色樣的卵巢組織并切除。假手術(shù)組切除兩側(cè)的脂肪樣組織作為對照?？p合固定并用慶大霉素消毒傷口連續(xù)消毒3 d防止傷口感染。將摘除的組織固定切片并行HE染色鑒定是否為卵巢組織。

1.2.2給藥方法：葛根素組(Pue)采用無菌生理鹽水將葛根素溶解，按每只2.5 mg/100 μL進(jìn)行腹腔注射，假手術(shù)組(Sham)和去卵巢組(Ovx)采用無菌生理鹽水等量腹腔注射。

1.2.3檢測指標(biāo)及檢測方法：①HE染色：將卵巢組織固定并石蠟包埋切片，然后用二甲苯脫蠟再用各濃度乙醇脫水，滴加蘇木精染液染色5 min，自來水沖洗。使用鹽酸乙醇分化數(shù)秒再用自來水沖洗加入伊紅染液。然后進(jìn)行脫水、透明、封片、顯微鏡觀察，拍照。將小鼠股骨脫鈣處理后按照上述染色方法行HE染色；②Micro-CT 取各組小鼠的股骨標(biāo)本清理干凈周邊組織然后放入4%多聚甲醛中固定24 h后進(jìn)行Micro CT掃描，得到三維Micro CT數(shù)據(jù)；③real-time PCR：采用EASYspin Plus骨組織RNA快速提取試劑盒提取樣本中總RNA，根據(jù)試劑盒操作按95 ℃，15 min，1個循環(huán)；95 ℃，10 s，58 ℃，30 s，72 ℃，30 s共40個循環(huán)進(jìn)行PCR反應(yīng)。β-actin上游引物序列為GTGACGTTGACATCCGTAAAGA，下游引物序列為GCCGGACTCATCGTACTCC；PTEN上游引物序列為TGGATTCGACTTAGACTTGACCT，下游引物序列為GCGGTGTCATAATGTCTCTCAG；FoxO1上游引物序列為ATGCTCAATCCAGAGGGAGG，下游引物序列為ACTCGCAGGCCACTTAGAAAA；catalas上游引物序列為AGCGACCAGATGAAGCAGTG，下游引物序列為TCCGCTCTCTGTCAAAGTGTG。④免疫組化：將骨組織切片脫蠟，DAB顯色，使用PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照，染色步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 去卵巢小鼠模型建立及評價(jià)

2.1.1卵巢組織的摘除：從小鼠背部雙側(cè)縱向切開，找到兩側(cè)粉紅色樣的卵巢組織切除并進(jìn)行HE染色，鏡下可見初級卵泡、次級卵泡。初級卵母細(xì)胞、透明帶，卵泡細(xì)胞等清晰可見，說明卵巢組織摘除成功。結(jié)果見圖1。

2.1.2卵巢組織摘除前后子宮形態(tài)對比：與Sham組相比，Ovx組小鼠子宮萎縮變小、輸卵管變細(xì)、長度縮短、管腔變窄、彈性下降。結(jié)果見圖2。

2.1.3卵巢組織摘除前后Micro-CT對比：與Sham組相比，Ovx組小鼠股骨的骨小梁結(jié)構(gòu)稀疏、斷裂明顯、骨皮質(zhì)變薄、骨髓腔變大。與Ovx組相比，Pue組小鼠骨小梁增多、斷裂減少、骨髓腔縮小。結(jié)果見圖3。

2.1.4卵巢組織摘除前后骨組織結(jié)構(gòu)變化：Sham組股骨組織結(jié)構(gòu)致密、骨小梁連接緊密、排列規(guī)律、少見斷裂、骨髓腔大小正常。與Sham組相比，Ovx組股骨組織分離度增大、骨小梁斷裂嚴(yán)重、骨髓腔明顯增大、空洞增多。與Ovx組相比，Pue組小鼠股骨組織骨小梁明顯增多、連接增多、骨小梁之間的間隙縮小、骨髓腔變小、結(jié)構(gòu)更致密。結(jié)果見圖4。

2.2 葛根素干預(yù)后各組的PCR和免疫組化結(jié)果

2.2.1葛根素干預(yù)后各組的PCR結(jié)果：與Ovx組相比，Pue組可以上調(diào)PTEN、Foxo1、Catalase的mRNA表達(dá)，PTEN、Catalase的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是Foxo1的mRNA改變無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2.2葛根素干預(yù)后各組的免疫組化結(jié)果：與Sham組相比，Ovx組的PTEN、catalase蛋白表達(dá)差異不明顯，而P-AKT蛋白表達(dá)增加。與Ovx組相比，Pue組的去卵巢小鼠骨組織內(nèi)陽性顆粒增多PTEN、catalase蛋白表達(dá)升高，P-AKT蛋白表達(dá)下調(diào)但變化差異不明顯。

3 討論

骨質(zhì)疏松癥是一種以骨密度降低，骨微結(jié)構(gòu)退化，骨折風(fēng)險(xiǎn)增加為特征的疾病。主要是由于骨吸收和骨形成之間的不平衡造成的[9]。骨質(zhì)疏松癥主要累及老年人，由于老齡化形勢的日益嚴(yán)峻，該疾病不僅對個人生活造成了極大影響，同時(shí)對于國家和社會來說也是一個沉重的負(fù)擔(dān)。目前椎體成形術(shù)，對于治療骨質(zhì)疏松癥致脆性骨折有一定療效[10]，但是骨折帶來的危害依然不容小覷。葛根素是一種植物雌激素，具有保護(hù)心腦血管、抗炎、抗氧化等功效[11]。方曉燕等[12]研究發(fā)現(xiàn)山茶籽和葛根素對去卵巢大鼠的骨質(zhì)疏松具有防治作用，但其具體作用機(jī)制尚不清楚。正如本研究所示，通過摘除小鼠雙側(cè)卵巢可以成功構(gòu)建絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥模型，經(jīng)過葛根素干預(yù)后小鼠的骨小梁增多，斷裂減少，骨髓腔縮小，說明葛根素對于骨質(zhì)疏松癥具有良好的治療作用。此外，與模型組相比，葛根素組PTEN的mRNA和蛋白表達(dá)均升高，說明PTEN可能對于葛根素治療骨質(zhì)疏松癥具有重要作用。

第10號染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物基因(PTEN)是一種抑癌基因，具有脂質(zhì)磷酸酶和蛋白磷酸酶雙重活性。PTEN通過使磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)的產(chǎn)物磷脂酰肌醇3磷酸(PIP3)脫磷酸化為磷脂酰肌醇2磷酸(PIP2)，抑制了蛋白激酶B(PKB/AKT)的磷酸化激活(p-AKT)，從而達(dá)到負(fù)性調(diào)控PI3K-AKT信號通路的作用[13]。PI3K-AKT信號通路對于細(xì)胞的生長、增殖、分化具有重要調(diào)節(jié)作用[14-15]。當(dāng)細(xì)胞受到信號刺激后，PI3K產(chǎn)生的PIP3使具有PH結(jié)構(gòu)域的AKT轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上，然后在3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1(PDK1)和3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶2(PDK2)的輔助下，將AKT蛋白的蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)(Thr308)和絲氨酸磷酸化位點(diǎn)(Ser473)磷酸化激活。磷酸化激活后的AKT進(jìn)一步影響下游的靶蛋白，從而發(fā)揮其促進(jìn)細(xì)胞生長、增殖、抑制凋亡的功能。研究表明，PI3K-AKT信號通路通過促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化和骨形成而參與骨質(zhì)疏松的抑制作用[16]。PI3K/AKT/GSK3β/NFATc1信號軸在RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成中起著非常重要的作用[17]。以上研究表明，PI3K-AKT信號通路通過選擇性地影響成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的生理功能，在維持骨量的動態(tài)平衡中發(fā)揮重要作用。

另外，氧化應(yīng)激過程中產(chǎn)生的大量活性氧通過促進(jìn)破骨細(xì)胞的生成從而加重骨質(zhì)疏松癥的進(jìn)程[18-20]，這說明氧化應(yīng)激也參與了骨量的調(diào)節(jié)，是骨質(zhì)疏松癥的危險(xiǎn)因素。本研究進(jìn)一步通過PCR和免疫組化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，葛根素組小鼠的PTEN、FoxO1、catalase的mRNA均上調(diào)，PTEN和catalase的蛋白表達(dá)水平上升，p-AKT蛋白表達(dá)水平下降。叉頭盒O轉(zhuǎn)錄因子(forkhead box O transcription factors，F(xiàn)oxOs)是重要的抗氧化因子，在4種FoxOs蛋白中(FoxO1、FoxO3、FoxO4、FoxO6)，只有FoxO1對成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的功能有影響。Foxo1通過上調(diào)過氧化物酶(catalase)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)等抗氧化酶的表達(dá)在調(diào)節(jié)骨量的穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用。以上結(jié)果表明，葛根素可能通過介導(dǎo)PTEN-PI3K-AKT信號通路抑制絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥。另有研究[21]發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇通過抑制PI3K-AKT信號通路上調(diào)了Foxo1的轉(zhuǎn)錄活性，從而增強(qiáng)了對氧化損傷的抵抗力并抑制了破骨細(xì)胞的生成。葛根素同白藜蘆醇一樣具有抗炎、抗氧化、清除氧自由基等功效。葛根素通過抑制破骨細(xì)胞中PI3K-AKT信號通路使得叉頭盒O轉(zhuǎn)錄因子1(forkhead box O transcription factor 1，F(xiàn)oxO1)高表達(dá)，使過氧化物酶(catalase)等抗氧化酶的表達(dá)來清除活性氧，從而達(dá)到治療骨質(zhì)疏松癥的目的[22-23]。由于絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥中破骨細(xì)胞功能亢進(jìn)[24-25]，猜想葛根素是否也可以通過升高PTEN負(fù)性調(diào)節(jié)PI3K-AKT信號通路，從而抑制破骨細(xì)胞的生成，進(jìn)而達(dá)到治療骨質(zhì)疏松癥的目的仍需進(jìn)一步探索。