張小蕊 黃惠娟 林妹珠倪清麗 王海紅 楊薈 張賢丹 李秋月 游夢(mèng)婷梁?jiǎn)㈠?/p>

1.福建醫(yī)科大學(xué)?？偱R床醫(yī)學(xué)院婦產(chǎn)科，福建 福州 350025

2.中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九○○醫(yī)院婦產(chǎn)科，福建 福州 350025

3.廈門大學(xué)附屬東方醫(yī)院，福建 福州 350025

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis, PMOP)是指女性絕經(jīng)后卵巢內(nèi)分泌功能失調(diào)衰退，雌激素水平明顯減少，導(dǎo)致以骨量減少、骨的微觀結(jié)構(gòu)退化為主要特征的一種全身代謝性疾病，易發(fā)生骨折。骨折以發(fā)生在腰部、股骨上端、腕骨較為常見。目前骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)診斷的主要基于雙能X射線吸收測(cè)定法(DXA)骨密度(bone mineral density，BMD)測(cè)量結(jié)果和(或)脆性骨折[1]。PM2.5是指空氣動(dòng)力學(xué)等效直徑等于和小于2.5 μm的大氣顆粒，其基本特征是體積小、重量輕，在大氣中滯留時(shí)間長(zhǎng)，可以被大氣環(huán)流輸送到很遠(yuǎn)的地方，因而對(duì)人體健康的影響很大[2]。根據(jù)相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，北京空氣中的PM 2.5濃度最高可達(dá)82.6 μg/m3[3]，同期北京當(dāng)?shù)鼐用竦?0～59歲骨質(zhì)疏松發(fā)病率為18.9%，60～69歲為52.21%，70～79歲為77.59%，80歲以上為95.24%，均高于同期PM2.5濃度較低的城市[4]。既往研究[5-7]表明，PM2.5可通過(guò)影響骨代謝的炎性效應(yīng)機(jī)制、受體競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制、雌孕激素受體機(jī)制等多種途徑降低骨密度，直接或間接引發(fā)或加劇OP。但PM2.5對(duì)于絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的影響機(jī)制還有待探討。本研究擬通過(guò)觀察PM2.5懸滴液滴注對(duì)去勢(shì)后雌性SD大鼠骨密度的影響，為PM2.5污染與絕經(jīng)后女性骨質(zhì)健康的關(guān)系提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物及分組

40只3周齡雌性Sprague-Dawley健康大鼠，動(dòng)物的數(shù)量由前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算得出，購(gòu)買上海于克萊斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，體重為(60±10)g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(滬)2017-0001。按照隨機(jī)數(shù)字表法將其分成對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組20只，飼養(yǎng)在聯(lián)勤保障部隊(duì)第九○○醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)動(dòng)物房，提供專用飼料飼養(yǎng)，保證每日光照時(shí)間一定，室溫 18～25 ℃，自由攝食和飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)管理依照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)指導(dǎo)方案進(jìn)行。

1.2 PM2.5的采集及配置

2018年4月至2019年4月，在聯(lián)勤保障部隊(duì)第九○○醫(yī)院婦產(chǎn)科病房樓樓頂(靠近福建省福州市鼓樓區(qū)西二環(huán)北路交通繁忙路段)用大流量采樣器和PM2.5采樣頭，收集本地區(qū)大氣PM2.5樣本。每連續(xù)采樣24 h更換一次濾膜。采樣后的濾膜用錫紙包裹，置于4 ℃保存。將PM2.5萃取后依據(jù)《中華人民共和國(guó)環(huán)境空氣質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(GB3095-2012)一、二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)日均濃度限值及我國(guó)城市PM2.5年平均濃度水平推算，將PM2.5粉末稱重，加入PBS磷酸緩沖鹽溶液配制成濃度為劑量75 μg/m3的懸濁液，保存于4 ℃冰箱中。

1.3 PM2.5暴露標(biāo)準(zhǔn)與氣道滴注方法

每天早上8：00開始，用乙醚麻醉雌鼠后，用氣管滴注法滴入大鼠肺部進(jìn)行染毒試驗(yàn)。依據(jù)《中華人民共和國(guó)環(huán)境空氣質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(GB3095-2012)一、二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)日均濃度限值及我國(guó)城市PM2.5年平均濃度水平，以及國(guó)際環(huán)保組織綠色和平發(fā)布的《2015年度中國(guó)366座城市PM2.5濃度排名》中PM2.5年均濃度150 μg/m3及參照吸入的PM2.5在氣道深部和肺的沉積率為70%進(jìn)行計(jì)算，計(jì)算得出大鼠24 h PM2.5吸入量分別為：5.52 μg/d。每隔2 d滴注1次，持續(xù)染毒9個(gè)月。

1.4 大鼠去勢(shì)術(shù)

PM2.5氣道滴注5月末，實(shí)驗(yàn)組大鼠行雙側(cè)卵巢切除術(shù)，對(duì)照組大鼠行雙側(cè)卵巢旁脂肪組織摘除術(shù)。大鼠于手術(shù)前一天禁食禁水6～8 h，使用3%濃度的戊巴比妥鈉對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉(1 mL/kg)，于大鼠中下背部備皮，手術(shù)切口選擇雙側(cè)背部長(zhǎng)度約1 cm的縱行切口，術(shù)中于卵巢與子宮末端之間的最細(xì)處用小號(hào)止血鉗夾閉，1號(hào)絲線結(jié)扎后切除全部卵巢，還納后分別縫合肌肉層和皮膚，對(duì)皮后酒精棉球消毒手術(shù)切口。術(shù)后3 d進(jìn)行肌注20萬(wàn)單位的青霉素1 mL/d。對(duì)照組采用同法切除雙側(cè)卵巢旁脂肪組織。

1.5 骨密度測(cè)量

在氣道滴注實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的第5、7個(gè)月末及9月末，對(duì)大鼠各部位進(jìn)行骨密度的測(cè)量，每次檢測(cè)前一天禁食禁水8 h，用3%濃度的戊巴比妥鈉對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉(1 mL/kg)，運(yùn)用雙能X線測(cè)量?jī)x設(shè)備(來(lái)源于福建省中醫(yī)藥研究院)在高分辨率模式下對(duì)大鼠右脛骨、右股骨、腰椎 (L4～L6)掃描。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中大鼠因手術(shù)或麻醉等原因出現(xiàn)死亡，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，對(duì)照組大鼠剩13只，實(shí)驗(yàn)組大鼠剩16只。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 PM2.5滴注5月末兩組骨密度比較

染毒5月末(未去勢(shì)前)，測(cè)量對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組脛骨、股骨、腰椎3個(gè)部位的骨密度，將對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的3個(gè)部位骨密度分別進(jìn)行比較，兩組脛骨、股骨、腰椎的骨密度差異均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 5月末骨密度變化Table 1 Bone mineral density change at the end of g/cm2)

2.2 離體后兩組骨密度變化

手術(shù)后持續(xù)染毒4個(gè)月后取大鼠右脛骨、右股骨及腰椎L4～L6離體測(cè)BMD(表2)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的脛骨、股骨、腰椎的骨密度差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 離體后骨密度變化Table 2 Change of bone mineral density after g/cm2)

2.3 對(duì)照組各部位骨密度變化

隨著染毒時(shí)間的增加，對(duì)照組3個(gè)部位骨密度均呈下降趨勢(shì)，其下降程度：腰椎>股骨>脛骨。見圖1。

2.4 實(shí)驗(yàn)組各部位骨密度變化

隨著染毒時(shí)間的增加，實(shí)驗(yàn)組3個(gè)部位骨密度均呈下降趨勢(shì)，其下降程度：腰椎>股骨>脛骨。見圖2。

2.5 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組股骨骨密度變化情況比較

隨著染毒時(shí)間增加，在同一時(shí)間段內(nèi)實(shí)驗(yàn)組股骨骨密度下降程度比對(duì)照組骨快，見圖3。

2.6 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組腰椎骨密度變化情況比較

隨著染毒時(shí)間增加，同一時(shí)間段內(nèi)實(shí)驗(yàn)組腰椎骨密度下降程度比對(duì)照組快，見圖4。

2.7 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組脛骨骨密度變化情況比較

隨著染毒時(shí)間增加，在7月末實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組脛骨骨密度較5月末均有下降，且實(shí)驗(yàn)組骨密度下降程度比對(duì)照組快；在9月末實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組脛骨密度均有所增加，且實(shí)驗(yàn)組骨密度上升程度比對(duì)照組慢。見圖5。

3 討論

從19世紀(jì)40年代Albright提出絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松與雌激素減少密切相關(guān)后，研究證實(shí)，雌激素水平的降低是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松發(fā)病的首要因素[8]。雌激素通過(guò)促進(jìn)IL-6、IL-1產(chǎn)生及抑制骨吸收抑制因子的作用使破骨細(xì)胞形成增加和抑制TGF-β及IGF作用抑制骨形成等途徑使骨量減少[9]。已有研究[10]表明，在中國(guó)同一地區(qū)內(nèi)絕經(jīng)前婦女骨質(zhì)疏松患病率(1.8%～3.2%)遠(yuǎn)低于絕經(jīng)后婦女患病率(9.4% ～ 37.9%)。本實(shí)驗(yàn)采用雌性SD大鼠進(jìn)行研究，去勢(shì)前PM2.5氣道滴注5月末測(cè)量實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組骨密度變化，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組脛骨、股骨和腰椎組間骨密度均未見明顯差異(表1)。對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別行去勢(shì)手術(shù)和假去勢(shì)手術(shù)后PM2.5持續(xù)氣道滴注4個(gè)月，再次測(cè)量BMD，結(jié)果顯示在相同PM2.5暴露時(shí)間下，去勢(shì)后SD大鼠腰椎、股骨和脛骨骨密度均較未去勢(shì)SD大鼠低(表2)，且隨著PM2.5氣道滴注時(shí)間的增加，卵巢去勢(shì)后雌性SD大鼠腰椎和股骨骨量的丟失速度顯著加快(圖3、圖4)。

臨床發(fā)現(xiàn)，不同骨骼部位骨量丟失的程度不同。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥所致的骨折常發(fā)生于脊柱、股骨頸和橈骨遠(yuǎn)端等富含松質(zhì)骨的部位，其中以腰椎最為常見。大量研究也表明，絕經(jīng)后婦女腰椎部位骨量的變化最明顯。本研究結(jié)果顯示，在相同濃度PM2.5暴露下，去勢(shì)后大鼠腰椎骨密度下降程度比股骨和脛骨明顯(圖2)。當(dāng)雌激素缺乏時(shí)，骨轉(zhuǎn)換增加，破骨細(xì)胞過(guò)于活躍，其功能相對(duì)或絕對(duì)增強(qiáng)，骨重建呈負(fù)平衡，引起骨量丟失，松質(zhì)骨骨小梁豐富，其對(duì)雌激素缺乏所致的骨量丟失的敏感性大于皮質(zhì)骨。本研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致[11]。

目前我國(guó)社會(huì)老齡化越來(lái)越嚴(yán)重，而隨著老齡化人口所占比例的上升，PMOP的患者也正逐年增多，而空氣污染的進(jìn)一步加重?zé)o疑是對(duì)PMOP患者病情的重大威脅。PMOP大大影響了絕經(jīng)后婦女的生活質(zhì)量，據(jù)調(diào)查，絕經(jīng)后的5～10年是骨質(zhì)疏松發(fā)生的高峰期，且發(fā)病率會(huì)隨著年齡增長(zhǎng)而增高。所以為改善絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松及骨質(zhì)疏松骨質(zhì)發(fā)生，需要有效的預(yù)防措施，其中控制空氣污染正是關(guān)鍵措施之一。

本項(xiàng)目通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來(lái)研究PM2.5懸濁液對(duì)絕經(jīng)后SD大鼠骨密度變化的影響，證明環(huán)境中的PM2.5對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松具有一定的作用，但具體影響的機(jī)制有哪些，是怎樣的作用原理，需要進(jìn)一步探究與證實(shí)。雖然大鼠骨質(zhì)疏松的模型建立后出現(xiàn)的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松變化與人類相似，但大鼠的骨結(jié)構(gòu)及代謝還是與人類的有所不同，且人類生存環(huán)境中空氣污染的程度不同，每個(gè)人的個(gè)體差異也均較實(shí)驗(yàn)大鼠差異性大，所以如果能結(jié)合流行病調(diào)查研究本研究結(jié)果將更具有說(shuō)服力。希望通過(guò)本研究能有更多的實(shí)驗(yàn)來(lái)研究PM2.5對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的影響；也希望能引起更多的人重視環(huán)境污染的問(wèn)題，減少PM2.5的排放，來(lái)降低其對(duì)女性絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的影響，使女性絕經(jīng)后生活質(zhì)量得到更大的提升。