方圣杰 章軼立 朱嘉 宋慶慧 王旭 劉寧 李秋月* 魏戌*

1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院，北京 100102

2.南京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院·中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，江蘇 南京 210023

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是骨科常見(jiàn)的疾病之一，骨量低、骨組織微結(jié)構(gòu)退化和骨強(qiáng)度降低是OP的主要特征[1]，OP主要分為原發(fā)性與繼發(fā)性?xún)深?lèi)，其中糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid，GC)誘導(dǎo)的OP為最常見(jiàn)的繼發(fā)性O(shè)P，有學(xué)者[2]對(duì)3 136例使用GC治療風(fēng)濕病患者時(shí)導(dǎo)致骨量減少、骨質(zhì)疏松發(fā)病情況進(jìn)行多中心調(diào)查，研究顯示存在骨量減少或骨質(zhì)疏松患者高達(dá)90%, 其中骨質(zhì)疏松的發(fā)生率為41.4%。相關(guān)機(jī)制研究證實(shí)，過(guò)量的GC會(huì)影響成骨細(xì)胞的分化和成熟，導(dǎo)致其數(shù)量和功能下降，并促進(jìn)成骨細(xì)胞凋亡，從而進(jìn)一步減少骨形成[3]。為進(jìn)一步更好的研制出療效顯著、價(jià)格低廉的治療GC性骨質(zhì)疏松癥藥物，建立可靠穩(wěn)定的糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥模型(glucocorticoid-induced osteoporosis，GIOP)并闡明GC誘導(dǎo)的OP的病理機(jī)制成為當(dāng)前首要任務(wù)[4]。

最近研究表明，GC能抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行成骨分化，引導(dǎo)其分化成脂肪細(xì)胞，同時(shí)，減少肥大軟骨細(xì)胞中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表達(dá)，使得成骨細(xì)胞和血流量減少[5]。Leptin作為脂肪因子的一種，存在于脂肪細(xì)胞中，相關(guān)機(jī)制研究闡明，Leptin能夠通過(guò)激活A(yù)kt調(diào)控成骨細(xì)胞的增殖、促進(jìn)成骨細(xì)胞分化[6]，同時(shí)，其在脂肪細(xì)胞中分泌后，釋放到血液中進(jìn)行循環(huán)[7]，能夠引起強(qiáng)烈的血管生成反應(yīng)，Leptin水平增加能夠促進(jìn)VEGF表達(dá)，與VEGF具有相互依賴(lài)性，因此被定義為促血管生成因子[8-10]。另外，骨修復(fù)過(guò)程是否受到VEGF水平影響？已有學(xué)者通過(guò)研究確證VEGF分泌能夠促進(jìn)骨修復(fù)，加快骨愈合，對(duì)骨缺損修復(fù)過(guò)程效果顯著，因此VEGF對(duì)骨修復(fù)及成骨細(xì)胞分化有著重要作用，該觀點(diǎn)也在醫(yī)學(xué)不同領(lǐng)域均有報(bào)道[11-15]，基于此，本文通過(guò)GIOP模型探究GC誘導(dǎo)OP過(guò)程中Leptin、VEGF蛋白表達(dá)情況，闡述GC誘導(dǎo)OP潛在病理機(jī)制，為后續(xù)進(jìn)一步科學(xué)研究及臨床治療以GIOP為代表的繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥提供可靠依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

相關(guān)試劑：蛋白提取液(來(lái)源：MDL，批號(hào)：MDL91201)；蛋白酶抑制劑(來(lái)源：MDL，批號(hào)：MD912893)；BCA 蛋白濃度測(cè)定 kit(來(lái)源：MDL，批號(hào)：MD913053)；SDS-PAGE 預(yù)制膠套裝 kit(來(lái)源：MDL，批號(hào)MD911919)；中等蛋白分子量 marker(來(lái)源：Thermo，批號(hào)：26617)；Leptin(來(lái)源：Bioss，批號(hào)：bs-0409R)；VEGF [來(lái)源：VEGF(C-1) sc-7269，批號(hào)：BA 0533]；二抗(來(lái)源：MDL，批號(hào)：MD912577)；無(wú)水乙醇(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；PBS 緩沖液(來(lái)源：艾普希隆生物，批號(hào)：G0002)

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器

微量加樣器(Gilson 公司，法國(guó))；電熱恒溫水浴槽(上海一恒恒溫設(shè)備廠，型號(hào)：HWS-24)；脫色搖床(海門(mén)其林貝爾儀器制造公司，型號(hào)：TS-100)；電泳儀(北京百晶生物技術(shù)有限公司，型號(hào)：T BG-subMIDI)；低溫離心機(jī)(Sigma，德國(guó)，型號(hào)：3-30K)；凝膠成像系統(tǒng)(UVP，美國(guó)，型號(hào)：GelDoc-It310)；ChemiDoc MP 化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(Bio-rad，美國(guó)，型號(hào)：170-8280)；病理切片機(jī) (上海徠卡儀器有限公司，型號(hào)：RM2016)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD雌性大鼠，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心技術(shù)有限公司，每只體重220 g左右，7周齡，共32只，飼養(yǎng)于SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室，濕度48%左右，溫度25 ℃左右，自由進(jìn)食、進(jìn)水，定時(shí)更換墊料。

1.4 分組與造模、取材

將大鼠隨機(jī)分為SHAM、DEX 2.5 mg/kg組、DEX 5 mg/kg組、DEX 7.5 mg/kg組，每組各8只。將大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開(kāi)始造模，我們將地塞米松注射液(dexamethasone，DEX)分為2.5、5.0、7.5 mg/kg三種劑量，分別對(duì)相應(yīng)組別大鼠選取左、右大腿內(nèi)側(cè)肌肉交替進(jìn)行肌肉注射，連續(xù)注射8周。在造模8周末，采用戊巴比妥依據(jù)大鼠體重進(jìn)行腹腔注射麻醉處死，取大鼠右側(cè)脛骨和右側(cè)股骨。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)

1.5.1骨密度檢測(cè)：選用雙能X線骨密度測(cè)量?jī)x進(jìn)行骨密度檢測(cè)，采用Osteocore3骨密度分析軟件進(jìn)行骨密度值的分析，選取右側(cè)脛骨樣本的脛骨骨干部進(jìn)行骨密度值的采集。

1.5.2病理組織學(xué)檢測(cè)：取右側(cè)脛骨在4%甲醛中固定12 h，流水沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋切片，進(jìn)行HE常規(guī)染色，在顯微鏡下觀察、拍照記錄。

1.5.3免疫組織化學(xué)檢測(cè)：選用右側(cè)脛骨，進(jìn)行免疫組化檢測(cè)。具體步驟：先將組織切片置于盛滿(mǎn) EDTA 抗原修復(fù)緩沖液(PH9.0)中進(jìn)行抗原修復(fù)，使用PBS洗滌3次，在切片上滴加 PBS 按一定比例配好的一抗，過(guò)夜，然后將玻片置于 PBS(pH 7.4)中洗滌 3 次后加二抗覆蓋組織，DAPI 復(fù)染細(xì)胞核，最后封片，鏡檢，記錄。

1.5.4蛋白免疫印跡：將股骨組織浸入液氮?jiǎng)驖{、離心、裂解、提取蛋白，進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定，根據(jù)蛋白定量結(jié)果，在電壓80 V下使樣品通過(guò)濃縮膠與分離膠至適當(dāng)位置后轉(zhuǎn)印至PVDF膜，將封閉后的膜分別加入對(duì)應(yīng)的一抗工作液中，4 ℃反應(yīng)過(guò)夜，使用1×TBST洗滌3次，洗凈未結(jié)合的一抗，在室溫、避光條件下放入二抗工作液中作用60 min，洗去二抗后進(jìn)行顯色與成像。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 骨密度檢測(cè)

DEX 2.5 mg/kg組、DEX 5 mg/kg組、DEX 7.5 mg/kg組右側(cè)脛骨骨密度較SHAM組骨密度均降低，DEX 2.5 mg/kg組較其他兩組降低更為顯著，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖1。

2.2 病理組織學(xué)檢測(cè)

病理組織學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，SHAM組骨小梁較厚，排列緊密，分布均勻，未有斷裂，與SHAM組相比DEX 2.5 mg/kg組、DEX 7.5 mg/kg組骨小梁變薄，排列較為稀疏，分布不均勻且有骨小梁斷裂，DEX 2.5 mg/kg組變化較其他組最為顯著。結(jié)合骨密度和病理組織學(xué)檢測(cè)結(jié)果，我們認(rèn)為DEX 2.5 mg/kg為地塞米松注射液誘導(dǎo)繼發(fā)性骨質(zhì)疏松的最佳造模劑量，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將以這個(gè)劑量為造模最佳劑量進(jìn)行研究。見(jiàn)圖2。

2.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè)

采用免疫組織化學(xué)對(duì)SHAM組、DEX 2.5 mg/kg組的Leptin、VEGF蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與SHAM組相比，DEX 2.5 mg/kg組大鼠Leptin、VEGF蛋白的表達(dá)均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

2.4 蛋白免疫印跡

蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，與SHAM組相比，DEX 2.5 mg/kg組大鼠Leptin、VEGF蛋白的表達(dá)均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

3 討論

GC的攝入是OP常見(jiàn)的繼發(fā)原因，也是該病常見(jiàn)的醫(yī)源性原因，其具體機(jī)制尚不清楚，有研究[16-17]表明，GC主要是通過(guò)抑制成骨細(xì)胞活性，延長(zhǎng)破骨細(xì)胞壽命，減少骨形成，最終誘導(dǎo)OP的形成。在祖國(guó)醫(yī)學(xué)中并沒(méi)有GIOP病名，GIOP屬于祖國(guó)醫(yī)學(xué)中“骨痿”“骨痹”等范疇，《素問(wèn)·痿論》提出“腎主身之骨髓…腎者，水臟，今水不勝火，則骨枯而髓虛，故足不住身，發(fā)為骨痿”?！端貑?wèn)·逆調(diào)論》認(rèn)為“腎不生則髓不能滿(mǎn)?！蹦I精不足致使骨髓生化乏源，形成骨痹。說(shuō)明了腎虛可為骨痿、骨痹的發(fā)病原因，《黃帝內(nèi)經(jīng)》記載，腎為先天之本，在體為骨，主骨生髓；肝為魂之處，血之藏，筋之宗，若肝血不足，隨之腎精虛損最終肝腎俱虛；脾為氣血生化之源，后天之本，開(kāi)竅于口，在體合肉，主四肢肌肉，若脾胃虛弱，氣血化生乏源，則精血不足，無(wú)以養(yǎng)髓，繼而肢體疼痛、痿弱，而最終導(dǎo)致OP，同時(shí)，現(xiàn)有研究顯示，肌肉含量與OP發(fā)病率具有密切關(guān)系[18]，遂肝脾腎三臟均與GIOP密切相關(guān)[19]。此外，祖國(guó)醫(yī)學(xué)認(rèn)為GC為“藥邪”，其性屬陽(yáng)，為辛溫發(fā)散之物，易傷陰液，陰虧無(wú)以生陽(yáng)，陰損及陽(yáng)，陰陽(yáng)失衡。因此藥邪傷腎, 腎精虧虛是GIOP發(fā)生的根本病機(jī)[20]。并且長(zhǎng)期攝入GC后，OP骨折風(fēng)險(xiǎn)也相應(yīng)提高，停用糖皮質(zhì)激素2～6個(gè)月后，骨折風(fēng)險(xiǎn)比繼續(xù)使用者低29%[21]。

Leptin是一種能作用于局部和全身的、具有多種功能的激素，不僅能控制飽腹感，與骨量和礦物質(zhì)密度有密切關(guān)系。有研究[22]表明，Leptin能夠激活JAK/STAT信號(hào)與BMP-9發(fā)揮協(xié)同作用，共同促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化。Bartell等[23]體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究闡明給與大鼠皮下注射Leptin后能夠促進(jìn)骨生長(zhǎng)，同時(shí)對(duì)血清OPG、骨鈣素劑量的依賴(lài)性增加，也確證瘦素對(duì)骨的代謝作用使得骨生長(zhǎng)增加。除能夠促進(jìn)成骨分化外，Leptin抑制人外周血單核細(xì)胞培養(yǎng)物中破骨細(xì)胞的生成，減少破骨細(xì)胞壽命[24-25]。

VEGF因誘導(dǎo)新血管生成已受到醫(yī)學(xué)各科廣泛關(guān)注，血管為骨組織提供氧氣、營(yíng)養(yǎng)、生長(zhǎng)因子和激素，在骨形成中起著至關(guān)重要的作用，與骨修復(fù)關(guān)系是不可分割的。在OP領(lǐng)域VEGF與骨細(xì)胞的相互作用已成為大家關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題，Street等[26]通過(guò)實(shí)驗(yàn)分別從抑制成骨細(xì)胞凋亡、促進(jìn)骨形成、修復(fù)骨損傷3個(gè)方面證實(shí)VEGF與骨形成之間的關(guān)系。此外Leptin從脂肪細(xì)胞分泌到血液系統(tǒng)，激活VEGF參與骨形成，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化已得到證實(shí)[9-10]。

本研究采用GIOP模型通過(guò)骨密度及病理組織學(xué)檢測(cè)確證了DEX 2.5 mg/kg劑量組為造模的最佳有效劑量，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)探究奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。在后續(xù)研究中我們采用免疫組織化學(xué)及蛋白免疫印跡檢測(cè)SHAM組和DEX 2.5 mg/kg劑量組的股骨，從組織形態(tài)學(xué)及蛋白水平闡明DEX 2.5 mg/kg組較SHAM組Leptin、VEGF蛋白表達(dá)顯著下降，證實(shí)了GC誘導(dǎo)的OP過(guò)程是通過(guò)抑制Leptin、VEGF蛋白表達(dá)，抑制血管生成及成骨分化發(fā)揮作用的。本研究為后續(xù)治療GIOP藥物的開(kāi)發(fā)提供了可靠證據(jù)和新的思路，為糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松的防治提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。