管晨，周闖，楊子明*，何祖宇，王超，劉運(yùn)浩，李秀娟，于麗娟，李雪瑞，屈云慧，李普旺*

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北武漢 430070）（2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所保鮮重點(diǎn)實(shí)驗室，廣東湛江 524091）（3.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，云南昆明 650000）

殼聚糖（CS）是甲殼素經(jīng)脫部分乙?；a(chǎn)生，呈現(xiàn)雙螺旋結(jié)果特征[1]。它天然無害、易降解、成膜性佳，因此廣泛應(yīng)用于各種功能高分子材料中[2]。然而，其在水中的溶解性很差，需要在酸性溶液中溶解，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)中的氨基質(zhì)子化（R-NH3+）[3]，這可能在體外和體內(nèi)應(yīng)用時引起毒性反應(yīng)[4]。在現(xiàn)存的各類殼聚糖衍生物中，羧甲基殼聚糖是一種重要的水溶性、生物相容性和生物降解性的物質(zhì)，有效避免質(zhì)子化現(xiàn)象并在市場上較易獲取[5]。使用羧甲基殼聚糖所制備的可食用性復(fù)合膜可以保持食品的固有風(fēng)味，增加食品的保質(zhì)期[6]。因此，對殼CS改性具有一定實(shí)用價值，使其具備了新的性能，以拓展其應(yīng)用領(lǐng)域。國內(nèi)外許多文獻(xiàn)中已經(jīng)對殼CS的改性有了較為細(xì)致的研究，如Zhang等[7]將 CS烷基化與氧化石墨復(fù)合制備產(chǎn)物,具有較好的生物相容性和力學(xué)性能；Wang等[8]改性了五種不同的水溶性季銨鹽殼聚糖，該類CS衍生物提升了抗菌性能并有良好生物相容性。根據(jù)殼CS的分子結(jié)構(gòu)將其化學(xué)改性方法分為酯化、接枝、?；?、席夫堿反應(yīng)以及季銨鹽反應(yīng)等[9]。膽酸（CA）是天然存在于人與動物體內(nèi)的有機(jī)物，因其化學(xué)結(jié)構(gòu)上含有羥基和長鏈羧基使其具有親水與憎水的雙性質(zhì)[10,11]，將CA接枝到CS氨基上，可使殼CS具備兩親性，兩親性殼聚糖自組裝形成的納米微膠囊在溶液中穩(wěn)定存在，可用于包埋難溶于水的物質(zhì)[12,13]。而單一組分的殼聚糖成膜機(jī)械性能差膜脆易斷裂，采用聚合物增強(qiáng)力學(xué)性能是制備薄膜材料常用的方法之一[14]。

結(jié)冷膠（GG）也叫凱可膠是一種天然陽離子多糖，包含摩爾比為 1:1:2的葡萄糖醛酸、鼠李糖和葡萄糖殘基組成的四糖單元線形多糖[15]，它具有高透明、耐酸廣、強(qiáng)穩(wěn)定性、凝膠性、風(fēng)味釋放性、耐高溫等性能[16,17]。由于酰基的存在，天然結(jié)GG柔軟而有彈性[18]，通過添加Ca2+、Na+和K+等陽離子或控制結(jié)GG的濃度可以調(diào)節(jié)聚合物機(jī)械性能[19,20]。GG作為一種安全、高效、高性能的凝膠，近年來在醫(yī)藥、食品、日用品等行業(yè)得到了廣泛的應(yīng)用[21]。例如GG作為增稠劑、穩(wěn)定劑應(yīng)用于酸奶、果醬、果凍布丁、調(diào)味料等食品中[22,23]。但GG在常溫下溶解易成凝膠的特性使其應(yīng)用受到限制，羧甲基化改性后，在室溫下溶解度增強(qiáng)，結(jié)晶度增加，隨著表面粗糙度的增加，陽離子誘導(dǎo)的凝膠作用并沒有降低生物相容性。本文將制備的水溶性羧甲基殼聚糖中加入CA改性，然后將改性CS與改性GG共混制備成膜，探究其成膜性能。

1 材料與方法

1.1 原料

結(jié)冷膠（GG，低?；?、丙三醇（Glycerol）、殼聚糖（CS，脫乙酰度＞90%）、氯乙酸（Chloroacetic acid），均采購于上海源葉試劑有限公司；異丙醇（Isopropyl alcohol）、氫氧化鈉（NaOH）、無水甲醇（Methanol）、無水乙醇（Ethanol），都購買于上海麥克林試劑有限公司；無水膽酸（Cholic acid 98%）、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺[1-(3-Dimethylarninopropyl)-3- ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC]、N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS），上海阿拉丁試劑有限公司?

1.2 儀器設(shè)備

傅里葉紅外光譜儀，天津港東公司；核磁共振（NMR）儀，蘇州紐邁公司；紫外分光光度儀，上海菁華分析儀器有限公司；恒溫水浴加熱磁力攪拌器，杭州大力科教儀器有限公司；真空冷凍干燥機(jī)，北京照生行儀器設(shè)備有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；電子萬能試驗機(jī)，揚(yáng)州德瑞儀器設(shè)備有限公司；熱重分析儀，北京北光宏遠(yuǎn)公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 羧甲基化殼聚糖的合成

水溶性羧甲基殼聚糖（CMCS）的合成如圖1所示，氯乙酸在堿性條件下反應(yīng)，羧甲基部分取代 CS上的氨基。稱取1 g 殼聚糖（CS）加入100 mL三口燒瓶中，加入20 mL異丙醇，于恒溫水浴磁力攪拌器上25 ℃下攪拌30 min使其溶脹，然后邊攪拌邊緩慢滴加20%氫氧化鈉溶液進(jìn)行堿化。稱取5 g的氯乙酸溶解于 50 mL蒸餾水中，分批滴加到以上溶液中，60 ℃加熱反應(yīng)3 h。將圓底燒瓶中物質(zhì)移入燒杯，加入冰醋酸調(diào)節(jié)pH為7.0，進(jìn)行抽濾，用無水乙醇多次洗滌，所得產(chǎn)物在冷凍干燥下后得到淡黃色CMCS[24]。

1.3.2 兩親性殼聚糖的合成

兩親性殼聚糖（CMCA-CA）的合成如圖1所示，先用氯乙酸在堿性條件下反應(yīng)，羧甲基部分取代 CS上的氨基，再進(jìn)行催化CA接枝。按文獻(xiàn)方法[25]，稱取1 g的1.3.1中制備的水溶性CMCS，加入50 mL去離子水磁力攪拌使其充分溶解。另稱取0.25 g的CA，加入無水甲醇充分溶解，分別稱取 0.25 g的催化劑EDC和NHS用甲醇溶解。然后，將CA、EDC與NHS溶液分別緩慢滴加到溶解后的CMCS溶液中，室溫下攪拌反應(yīng)24 h。將反應(yīng)產(chǎn)物用去離子水透析（截留分子質(zhì)量7000 Da）3 d，最后，將透析后的溶液預(yù)凍后再真空冷凍干燥，得到CMCS-CA[26]。

1.3.3 羧甲基結(jié)冷膠的合成

羧甲基結(jié)冷膠（CMGG）合成如圖2所示。稱取2 g GG和10 g氫氧化鈉加入到50 mL蒸餾水中，在50 ℃下攪拌30 min制備成為水性分散體，磁力攪拌下滴加50 mL濃度為20%氯乙酸水溶液。然后在水浴磁力攪拌下將反應(yīng)混合物加熱至70 ℃，反應(yīng)30 min，冷卻后倒入透析袋（截留分子質(zhì)量7000 Da），透析3 d，去除多余的氫氧化鈉使溶液呈中性，預(yù)凍后再進(jìn)行冷凍干燥得到CMGG。在0 ℃下，當(dāng)CMGG溶液濃度達(dá)到10%以上時，也不會再形成凝膠狀[27]。

1.3.4 取代度與接枝率

（1）羧甲基化取代度的測定：羧甲基化取代度通過酸堿滴定法計算[28]。具體步驟如下：新制備的CMGG樣品通過透析后冷凍干燥得到。稱取1.0 g的CMGG，加入0.1 mol/L的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液10 mL，攪拌充分溶解，再加入兩滴0.5%酚酞。再用0.1 mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定消耗過量氫氧化鈉，溶液變?yōu)闊o色，記錄此時鹽酸的體積V。

式中：

10-V——每克CMGG所需的氫氧化鈉的毫升數(shù)。

（2）殼聚糖接枝率：準(zhǔn)確稱取CS 50 mg，用10 mL 0.5 mol/L的醋酸溶解，待 CS完全溶解后再用 0.5 moL/L的醋酸定容至100 mL。制備CS標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為0.5 g/L，再準(zhǔn)確移取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL CS標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到10 mL比色管中，并依次分別加入1.0 mL pH值為5.5的醋酸鈉緩沖液和1%茚三酮試劑，加去離子水補(bǔ)足5.0 mL。搖勻后于沸水浴加熱20 min，直到變?yōu)樽仙笕〕隼鋮s，加蒸餾水定容到10 mL，搖勻，以去離子水為空白在570 nm處測定吸光度[29]。得到吸光度A與樣品濃度C的線性回歸方程為C=aA+b。按2 mg/mL濃度配制兩親性殼聚糖（CMCS-CA）溶液，分別測定其吸光度，由線性回歸方程C=aA+b，可以計算出相應(yīng)的游離氨基量C，則接枝率Y=100%-C[29]。

1.3.5 兩親性殼聚糖/羧甲基結(jié)冷膠薄膜的制備

（1）CMCS-CA水溶液：稱取五份0.5 g冷凍干燥得到的CMCS-CA樣品于燒杯，加入20 mL蒸餾水，常溫磁力攪拌下充分溶解，制備成CMCS-CA水溶液。

（2）CMGG水溶液：以CMCS-CA為標(biāo)準(zhǔn)，稱取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g五個不同質(zhì)量的CMGG樣品，加入20 mL去離子水，常溫下磁力攪拌充分溶解后制備成CMGG水溶液。

（3）復(fù)合膜的制備：將上述的溶液混合，得到CMCS-CA和CMGG為5:0、5:1、5:2、5:3、5:4、5:5六個不同質(zhì)量比的復(fù)合涂膜溶液，向其中分別加入2%的甘油，磁力攪拌30 min充分混合。將得到的均勻復(fù)合膜溶液倒入直徑為90 mm玻璃培養(yǎng)皿中，在室溫下放置1 h以消除氣泡。最后放入55 ℃的鼓風(fēng)干燥箱中，24 h干燥成膜[30]。

1.3.6 測試與表征

（1）FT-IR測試：采用傅里葉變換紅外光譜儀表征。樣品進(jìn)行KBr壓片法制備，再從4000 cm-1到500 cm-1波長下進(jìn)行掃描，掃描間距為 4 cm-1，分別測定CMCS-CA及CMGG的化學(xué)基團(tuán)。

（2）1HNMR分析：分別取一定量CS衍生物及GG衍生物溶于適量的D2O混合液中，待樣品完全溶解后進(jìn)行測定核磁圖譜。

（3）熱重分析（TGA）：TGA主要用來了解復(fù)合物的熱穩(wěn)定，熱分解情況的變化。通入氮?dú)庠?0～600 ℃的溫度范圍內(nèi)，以20 ℃/min的速率均勻加熱。

（4）透光率：采用紫外分光光度計檢測復(fù)合膜的透光率，將復(fù)合膜尺寸裁剪為10 mm×50 mm的矩形，將膜樣品附著在比色皿光滑面外側(cè)，在500 nm下測試膜的透光率，以空氣作為空白對照，每個樣品均進(jìn)行三次平行實(shí)驗。

（5）吸水率分析：將復(fù)合膜裁剪成20 mm×20 mm的正方形，烘箱 55 ℃使膜表面干燥，用分析天平進(jìn)行稱量，然后將其放入等重的蒸餾水中，直到形狀變化較小無破裂吸水完全，用濾紙蘸去膜表面水分，稱重直至恒重，每個樣品均進(jìn)行三次平行實(shí)驗（同時進(jìn)行）。

（6）機(jī)械性能：將復(fù)合膜裁剪為40 mm×10 mm的長條，保存于恒溫恒濕試驗箱中，測試取出。把樣品安裝在適合的夾具上，夾具間長度為20 mm，再分別測試每個樣品的拉伸性能，拉伸速度為10 mm/min，每個樣品均進(jìn)行三次平行實(shí)驗。

（7）感官性能評價：通過表面光滑度、揭膜難易、顏色透明度、氣味綜合評分滿分為12分：揭膜難易度分3級評分，即易、一般、難，分值分別為3、2、1分；顏色和透明度分為透明3分，微黃透明2分，黃色透明1分；異味分3級評分，即：有、微有、無，分值分別為1、2、3分；表面光滑度為3級評分，即：好、一般、差，分值分別為3、2、1。

1.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實(shí)驗結(jié)果中采用Excel軟件和MestReNova進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，Origin 8.5軟件作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 殼聚糖與結(jié)冷膠取代度

GG與氯乙酸質(zhì)量比 1:5反應(yīng)產(chǎn)物通過酸堿滴定法測得消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液V=6 mL，CMGG的取代度根據(jù)1.3.4公式計算得到DS≈0.84。CMCS的取代度通過酸堿滴定法確定在約80%，再通過茚三酮比色法測定CS原料的氨基含量獲得線性回歸方程如圖 3所示，y=0.00703x+0.04641，R2=0.9992。吸光度A與樣品濃度 C的關(guān)系為 C=142.2A-6.60，測樣品 A為0.12，接枝率為89.54%，CA接枝率約為9.54%。

2.2 殼聚糖與結(jié)冷膠衍生物的紅外光譜分析

圖4為GG和CMGG傅里葉紅外圖譜的比較，3300 cm-1、2890 cm-1等處的峰屬于-OH、-CH2伸縮振動寬展峰；1570 cm-1、1405 cm-1、1050 cm-1等處分別屬于C=O、COO-、C-O伸縮振動峰。這些峰強(qiáng)度均有增強(qiáng)。表明，羧甲基成功修飾到結(jié)冷膠上。

圖5為CS與CMCS及CMCS-CA的紅外圖譜比較，CMCS中的 3408 cm-1左右的強(qiáng)寬吸收峰為-OH和-NH2的伸縮振動吸收峰，在2920 cm-1左右的吸收峰是C-H鍵的伸縮振動，1607 cm-1左右和1420 cm-1左右分別對應(yīng)羧基的不對稱和對稱吸收峰，1062 cm-1為C-O-C鍵的伸縮振動峰。在圖5中CMCA-CA出現(xiàn)新的峰 1690 cm-1處于酰胺Ⅰ帶，酰胺基存在，表示CA接枝成功。

2.3 殼聚糖與結(jié)冷膠衍生物的核磁氫譜分析

圖6是GG和CMGG的核磁氫譜圖。CMGG和GG比較，在4.26×10-6處，出現(xiàn)新的峰，氯乙酸鈉中CH2的化學(xué)位移為4.30×10-6。表明羧甲基成功修飾到結(jié)冷膠上。

圖7是CS、CMCS與CMCS-CA的核磁氫譜圖，在 CMCS 的1HNMR 中，在 3.50×10-6～4.00×10-6間出現(xiàn)了典型的 C2位取代的羧甲基質(zhì)子的信號峰（-NHCH2COOH），說明羧甲基被成功接枝到CS上。CS 的特征峰4.75 ppm（糖環(huán) H-1）、3.30×10-6～3.90×10-6（糖環(huán) H-3、H-4、H-5、H-6）。而0.60×10-6～2.00×10-6間出現(xiàn)的多重峰為CA的核磁共振峰，表明在聚合物中有CA基團(tuán)存在。

2.4 殼聚糖與結(jié)冷膠衍生物復(fù)合膜的熱重曲線圖

圖8和圖9是為CMGG與CMCS-CA不同比例的復(fù)合膜的TG和DTG圖譜。不同比例的復(fù)合膜的熱降解過程類似，均分為三個階段。其中第一階段溫度50～105 ℃加熱復(fù)合膜，質(zhì)量減少l0.70%表明復(fù)合膜表面所含水分的蒸發(fā)，膜中含有的水分（含結(jié)合水）的汽化以及成膜體系中增塑劑的揮發(fā)吸收熱量。第二階段降解起始點(diǎn)約為150 ℃，最大降解速率在235 ℃左右達(dá)到，在400 ℃左右結(jié)束，此階段熱降解速率最快。這主要是交聯(lián)成膜聚合物的降解和成膜焦炭的形成。第三階段發(fā)生在＞400 ℃以上，主要是復(fù)合膜對應(yīng)的碳塊的熱降解。綜上所述，五條曲線的分解過程是連續(xù)的，其最大熱降解溫度分別達(dá)到230、260、240、235、235 ℃，CMCS-CA與CMGG的復(fù)合膜具有良好的熱穩(wěn)定性。

在圖中五個不同比例中熱降解過程基本類似，第一階段除5:3比例外均失重較多，約20%，并且在GG比例不斷增多時第二階段的最大降解速率均推遲，CMCS-CA:CMGG=5:2比例最大降解速率推遲最為明顯達(dá)到260 ℃左右。因此，CMGG添加到適當(dāng)比例可以增加CS的熱穩(wěn)定性，提升熱降解溫度并減緩了其熱降解的速率。這一結(jié)果的出現(xiàn)是不同的生物大分子間發(fā)生強(qiáng)烈相互作用而導(dǎo)致，也可能由于 GG帶著負(fù)電基團(tuán)COO-，殼聚糖帶正電存在靜電相互作用而形成[31]。

2.5 復(fù)合膜的透光率和吸水率分析

透光率是指光透過透明體或者半透明體的透過光與其入射光量的百分比。它對人們的視覺效果有直接影響, 尤其是在食品包裝領(lǐng)域是較為重要的參考指標(biāo)。當(dāng)復(fù)合膜應(yīng)用在果蔬保鮮，要考慮成膜后對果蔬的顏色影響。圖10可知CMGG的添加對透光率的影響。紫外分光光度計在500 nm處檢測復(fù)合膜的透光率，CMCS-CA:CMGG比例為5:0、5:1、5:2、5:3、5:4、5:5對應(yīng)的復(fù)合膜的透光率為92.20%、86.10%、84%、77.50%、70%、60%?？傮w上呈下降趨勢，當(dāng)復(fù)合膜的透光率達(dá)到80%以上，才屬于透明性材料。透光率可能因為隨著 CMGG含量的增加而下降，因此復(fù)合膜的混合比例取5:1、5:2時可保持較高的透光率。

CMGG添加量對CMCS-CA/CMGG復(fù)合膜的吸水率影響較大，由圖10可知隨著CMGG的含量的增加，CMCS-CA/CMGG復(fù)合膜的吸水率呈上升趨勢。在整個吸水膨脹的過程中發(fā)現(xiàn)，復(fù)合膜起始吸水速度較快，大約在12 h左右吸水溶脹達(dá)到平衡之后變化較小或發(fā)生破裂，而純CMCS-CA在12 h內(nèi)已經(jīng)部分破裂溶解無法進(jìn)行測量稱重。上述五個比例復(fù)合膜取平衡時吸水率進(jìn)行比較，CMCS-CA/CMGG比例在 5:4和5:5時吸水率最大，達(dá)到700%以上，說明CMGG的加入對復(fù)合膜的吸水性影響較大，應(yīng)該與GG的保水性有關(guān)，結(jié)合復(fù)合膜的透光性能，復(fù)合膜的CMGG的比例在5:1～5:3范圍內(nèi)較好。

2.6 機(jī)械性能

復(fù)合膜的機(jī)械性能用拉伸強(qiáng)度和斷裂延伸率來表示，對比可見單一CMCS-CA膜的機(jī)械性能較差，而添加CMGG的復(fù)合膜中CMCS-CA:CMGG的比例為5:2時成膜的機(jī)械性能最優(yōu)，拉伸強(qiáng)度最大為 3.35 MPa，同時其斷裂伸長率達(dá)到111.0%。適量的CMGG的加入增強(qiáng)復(fù)合膜的機(jī)械性能，這可能是因為引入了更多的羥基官能團(tuán)，使其與羥基或氨基官能團(tuán)相互作用而使膜結(jié)合更加緊密[32]。同時適量的增塑劑可使復(fù)合膜分子間相互作用更加緊密，從而提高其機(jī)械性能。

圖11是關(guān)于在不同CMGG的添加量中復(fù)合膜的斷裂伸長率和拉伸強(qiáng)度變化曲線圖。從圖中可以看出，一定范圍內(nèi)，隨著 CMGG的添加復(fù)合膜機(jī)械性能先升高后下降，添加比例達(dá)到5:2時，成膜的機(jī)械性能最優(yōu)，繼續(xù)添加其拉伸強(qiáng)度和斷裂伸長率開始下降，說明 CMGG的添加控制在適當(dāng)濃度可調(diào)節(jié)膜的機(jī)械性能。

2.7 感觀性能

表1 不同比例的復(fù)合膜感觀質(zhì)量的影響Table 1 Effect of different proportion of composite membrane on sensory quality

表1對CMCS-CA:CMGG=5:0、5:1、5:2、5:3、5:4、5:5五個比例的復(fù)合膜進(jìn)行揭膜難易、顏色透明度、表面光滑度（指制備薄膜的表面平整度、厚度均勻性、表面氣泡和細(xì)小顆粒的多少）及氣味的比較[33]。添加 CMGG的復(fù)合膜顏色呈淡黃色，隨著添加濃度的升高顏色不斷加深，透明度降低，達(dá)到一定濃度復(fù)合膜會產(chǎn)生輕微異味但表面光滑度都表現(xiàn)良好。同時濃度的增加使薄膜更易脫離揭膜，通過感官質(zhì)量的比較CMCS-CA:CMGG=5:1、5:2的比例復(fù)合膜性能表現(xiàn)良好。

3 結(jié)論

本文通過 CA與羧甲基化修飾 CS、羧甲基改性GG，然后將CMCS-CA:CMGG按照五個不同比例（5:1、5:2、5:3、5:4、5:5）混合，加入丙三醇為增塑劑，55 ℃，24 h烘干制備成膜。并通過傅里葉紅外光譜、核磁氫譜、熱重分析、物理機(jī)械性能透明度、吸光度、感觀質(zhì)量分析得出以下結(jié)論：

（1）CMGG制備的取代度約為 84%左右，CMCS-CA制備條件為選定 80%左右取代度的CMCS，測定 CA接枝率為 9.54%，并以CMCS:CA質(zhì)量比為4:1，常溫，反應(yīng)時間24 h。

（2）CMCS-CA:CMGG不同比例制備的復(fù)合膜熱學(xué)、力學(xué)、光學(xué)性能有著顯著的差異。在熱重分析中CMCS-CA:CMGG=5:2比例的最大降解速率提高最為明顯達(dá)到260 ℃左右，具有最優(yōu)的熱穩(wěn)定性。復(fù)合膜的力學(xué)性能曲線中拉伸強(qiáng)度在 5:2時最大為 3.35 MPa，比其他比例均高，同時其斷裂伸長率達(dá)到111.00%，復(fù)合膜的機(jī)械性能達(dá)到最優(yōu)。同時紫外測定5:2比例的復(fù)合膜的透明度84%保持較高，感觀評定較好。

（3）本研究中對GG進(jìn)行改性使其具備了易溶于水的性能，同時對CS進(jìn)行兩親性改性使其直接溶于水并為后續(xù)研究中包埋難溶于水的物質(zhì)打下基礎(chǔ)，最后將制備的改性CS與改性GG復(fù)合成膜，CMGG的加入改善了CMCS-CA單獨(dú)成膜的熱穩(wěn)定性與機(jī)械性能，同時保持良好的透明度、吸水率和感觀質(zhì)量。