林曉雅，鄧銳杰，李海濤，楊淏，劉俊

（1.四川大學(xué)輕工科學(xué)與工程學(xué)院，四川成都 610065）（2.天津市理化分析中心有限公司，天津 300051）（3.成都海關(guān)技術(shù)中心，四川成都 610041）

目前，水體與土壤的重金屬污染情況十分嚴(yán)峻[1]，由于農(nóng)藥、化肥濫用以及垃圾排放，我國(guó)農(nóng)田重金屬污染率超過(guò)50%[2,3]，此外，江河湖庫(kù)底質(zhì)的重金屬污染程度突破80%[4]，其中，重金屬銅污染顯著，排放量約為3.4×106t/年[2]。水體與土壤中的銅可通過(guò)工廠加工等方式轉(zhuǎn)移富集于食品中，從而造成食品的重金屬銅污染。美國(guó)環(huán)境保護(hù)署（EPA）將自來(lái)水中的銅離子含量限制設(shè)置為 20 μmol/L[5]，世界衛(wèi)生組織（WHO）設(shè)置飲用水中銅離子含量限制為 30 μmol/L[6,7]，而我國(guó)也有相關(guān)銅含量限制，如限制飲用水中銅離子的最高濃度為15.6 μmol/L[8]，葡萄酒中銅離子含量為 1.0 mg/L[9]。傳統(tǒng)的銅離子（Cu2+）檢測(cè)方法包括原子吸收光譜法（AAS）[10]、原子發(fā)射光譜法（AES）[11]、電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS）[12]、分光光度法[13]和伏安測(cè)量法[14]等，這些檢測(cè)方法具有靈敏度高和選擇性好的優(yōu)點(diǎn)，但是普遍存在操作復(fù)雜、樣品前處理繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)和檢測(cè)成本高等缺點(diǎn)。近年來(lái)，聚苯胺光譜法[15]和熒光探針?lè)╗16]等新型檢測(cè)方法被應(yīng)用于銅離子檢測(cè)中，這些方法耗時(shí)短、成本較低，但大多仍存在前處理復(fù)雜和檢測(cè)環(huán)境要求高的特點(diǎn)。因此，建立一種檢測(cè)時(shí)間短、條件要求低和成本低的銅離子檢測(cè)手段是十分重要的。

碳點(diǎn)（Carbon dots，CDs）是指粒徑一般小于10 nm的新型熒光碳納米材料[17]，是熒光染料、量子點(diǎn)和細(xì)胞內(nèi)傳感的替代品，具有優(yōu)異的生物相容性[18]、良好的光穩(wěn)定性[19]和生物低毒性[20]等優(yōu)點(diǎn)。碳點(diǎn)的應(yīng)用廣泛，包括重金屬檢測(cè)[21,22]、分子熒光分析[23,24]、細(xì)胞標(biāo)定[25]與藥物傳遞[26]。

本文合成熒光碳量子點(diǎn)并將其應(yīng)用于食品中銅污染的均相快速檢測(cè)。主要探究碳量子點(diǎn)對(duì)Cu2+的響應(yīng)動(dòng)力學(xué)，優(yōu)化了碳量子點(diǎn)的濃度，驗(yàn)證碳量子點(diǎn)檢測(cè)Cu2+的選擇性及定量的線性關(guān)系，從而，建立了一種Cu2+的均相快速檢測(cè)方法。該方法可以在一個(gè)離心管內(nèi)、在室溫環(huán)境下對(duì)Cu2+實(shí)現(xiàn)高靈敏檢測(cè)，檢測(cè)動(dòng)態(tài)范圍是 5～50 μmol/L，檢出限為 5.48 μmol/L。該碳量子點(diǎn)有望應(yīng)用于食品Cu2+污染的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，作為食品Cu2+污染的防控工具。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

Synergy H1熒光多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)伯騰儀器有限公司；JEM-2100透射電子顯微鏡，日本電子公司；UV-1800BPC紫外可見分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司。

L-色氨酸、海藻酸鈉，上海麥克林生化科技有限公司；氯化銅，四川科倫藥業(yè)股份有限公司；MES buffer，北京百奧萊博科技有限公司；甲苯，泉州愛(ài)德利貿(mào)易有限公司。實(shí)驗(yàn)用水為分子生物級(jí)水，美國(guó)紐約康寧。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 碳點(diǎn)的制備

2.0 g海藻酸鈉粉末與1.0 g色氨酸粉末混合均勻后移入至高壓釜中，于220 ℃下持續(xù)反應(yīng)6 h，得到的棕色混合物，然后加入乙醇進(jìn)行溶解，并于 10000 r/min下離心10 min，收集棕黃色上清液。將收集的液體與甲苯混合[乙醇:甲苯（V/V）=1:3]，于12000 r/min下離心30 min，將離心后的沉淀物置于60 ℃下進(jìn)行干燥，最后得到棕色粉末即為所需要的碳點(diǎn)[27]。

1.2.2 熒光量子產(chǎn)率測(cè)定

碳點(diǎn)的熒光量子產(chǎn)率測(cè)定以溶于0.1 mol/L硫酸的硫酸奎寧作為參比物質(zhì)，室溫下測(cè)定。先測(cè)量碳點(diǎn)和硫酸奎寧溶液在碳點(diǎn)最佳激發(fā)波長(zhǎng)條件下的積分熒光強(qiáng)度和該激發(fā)波長(zhǎng)下的吸光度，然后按照以下公式計(jì)算碳點(diǎn)的熒光量子產(chǎn)率[28-30]。

式中：

YU——待測(cè)未知樣品的熒光量子產(chǎn)率；

YS——標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的熒光量子產(chǎn)率；

FU——待測(cè)樣的積分熒光強(qiáng)度；

FS——標(biāo)準(zhǔn)物稀溶液的積分熒光強(qiáng)度；

AU——待測(cè)樣在同一激發(fā)波長(zhǎng)下的最大吸光度值；

AS——標(biāo)準(zhǔn)物稀溶液在同一激發(fā)波長(zhǎng)下的最大吸光度值。

1.2.3 靶標(biāo)Cu2+的檢測(cè)

在離心管各加入0.1 mol/L MES buffer、20 μg/mL CDs溶液、再分別加入一系列濃度的Cu2+溶液（50、30、20、10、5 μmol/L），震蕩反應(yīng)后，加入384微孔板中，然后立即放入多功能微孔板檢測(cè)儀中測(cè)定熒光強(qiáng)度，設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)為360 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為420～600 nm。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光測(cè)定

探究了時(shí)間參數(shù)對(duì)檢測(cè)效果與熒光強(qiáng)度變化的影響。將所有的試劑加入384微孔板中，然后立即放入多功能微孔板檢測(cè)儀中實(shí)時(shí)測(cè)定熒光強(qiáng)度，檢測(cè)時(shí)間為 0～60 min。

1.2.5 選擇性測(cè)試

為了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)所制備CDs的特異性，選擇了Na+、K+、Ag+、Ca2+、Mn2+和 Mg2+作為干擾物與 Cu2+進(jìn)行比較。首先在離心管中加入500 μmol/L的金屬離子、0.1 mol/L MES buffer、20 μg/mL CDs溶液，震蕩反應(yīng)，再將混合液體加入到384微孔板中立即用多功能微孔板檢測(cè)儀測(cè)定熒光強(qiáng)度。

1.2.6 樣品測(cè)定

（1）樣品處理：用自來(lái)水配制一系列濃度梯度的Cu2+溶液（10、30、50 μmol/L）。

（2）實(shí)際樣品熒光測(cè)定：3 μL樣品溶液、15 μL MES buffer（0.1 mol/L）、3 μL CDs溶液（20 μg/mL）加入離心管中反應(yīng)，將混合溶液注入到384孔板中，用多功能微孔板檢測(cè)儀對(duì)其進(jìn)行熒光檢測(cè)，記錄在420 nm處的熒光值，根據(jù)實(shí)驗(yàn)所得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式計(jì)算出Cu2+的濃度。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

本方法所有試驗(yàn)均重復(fù)測(cè)定3次，采用OriginPro 8.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 碳點(diǎn)的表征及Cu2+的檢測(cè)原理

由于內(nèi)濾光效應(yīng)（IFE）[31]和靜態(tài)淬火效應(yīng)（SQE）的協(xié)同作用，Cu2+可以對(duì)CDs熒光團(tuán)的激發(fā)光進(jìn)行重新吸收，同時(shí)，CDs上的氨基可以捕獲Cu2+，并形成特定的復(fù)合物，然后通過(guò)非輻射電子轉(zhuǎn)移過(guò)程導(dǎo)致CDs的強(qiáng)熒光淬滅，從而顯著抑制CDs的熒光信號(hào)。如圖1a，20 μg/mL的CDs溶液于激發(fā)條件下具有高熒光信號(hào)，在加入1 mmol/L的Cu2+溶液后，在同一激發(fā)條件下熒光信號(hào)被猝滅。因此，可通過(guò)測(cè)定反應(yīng)溶液熒光強(qiáng)度的差異可用來(lái)定量Cu2+。

利用掃描透射電鏡（TEM）對(duì)合成的CDs的形態(tài)進(jìn)行了表征。如圖1b，合成的碳量子點(diǎn)幾乎是均勻分布的，尺寸大約為9～18 nm。

熒光量子產(chǎn)率表示物質(zhì)發(fā)射熒光的總能量與吸收能量之比[32]，采用相對(duì)法進(jìn)行計(jì)算，選擇硫酸奎寧作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，通過(guò)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物和碳點(diǎn)樣品進(jìn)行吸光度和熒光的測(cè)量與換算，進(jìn)而得到樣品的相對(duì)熒光量子產(chǎn)率[33,34]。硫酸奎寧在0.1 mol/L H2SO4中的熒光量子產(chǎn)率為54%[35]，測(cè)得同濃度CDs溶液與硫酸奎寧溶液的吸光度分別為0.09、0.23。熒光強(qiáng)度（圖1c），可得積分熒光分別為1612308、6939197，代入1.2.2中的公式計(jì)算可得碳點(diǎn)的熒光量子產(chǎn)率為33.27%。

2.2 檢測(cè)條件優(yōu)化

該檢測(cè)方法只涉及一個(gè)響應(yīng)納米材料，因此僅需要優(yōu)化CDs的濃度。選擇了濃度為0.5、1、5、10、20和30 μg/mL的CDs進(jìn)行熒光分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2a顯示，隨著碳點(diǎn)濃度的增長(zhǎng)，熒光強(qiáng)度越強(qiáng)，而當(dāng)CDs濃度為20 μg/mL時(shí)，背景與信號(hào)的比值（噪信比）最大，故而后續(xù)實(shí)驗(yàn)CDs的濃度一律選用20 μg/mL。

研究了銅離子淬滅CDs熒光的實(shí)時(shí)響應(yīng)（圖2b）。Cu2+的加入會(huì)導(dǎo)致CDs的熒光值迅速降低，因此，CDs可以實(shí)現(xiàn)對(duì)Cu2+的快速響應(yīng)?；贑Ds的熒光傳感方法與熒光探針?lè)╗36-38]同樣具有優(yōu)異的時(shí)效性，可以實(shí)現(xiàn)快速的Cu2+檢測(cè)。

2.3 Cu2+的定量檢測(cè)

表1 不同Cu2+檢測(cè)方法的比較Table 1 Comparison of different detection methods for Cu2+

為確保所制備的碳量子點(diǎn)可以用于 Cu2+定量檢測(cè)，研究了碳點(diǎn)對(duì)不同濃度的 Cu2+的響應(yīng)情況，熒光信號(hào)變化如圖3所示，熒光值隨著Cu2+濃度的增加而逐漸降低，且Cu2+在0.70～1.70 lg μmol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（圖 3），計(jì)算出檢測(cè)限為 5.48 μmol/L（Y=-26744X+58501；R2=0.9956）。美國(guó)環(huán)境保護(hù)署（EPA）將自來(lái)水中的 Cu2+的水平限制在 20 μmol/L[5]，世界衛(wèi)生組織（WHO）將飲用水中 Cu2+水平管制為30 μmol/L[6,7]，國(guó)標(biāo)限定飲用水中銅離子的最高濃度為15.6 μmol/L[8]。本方法的檢出限（LOD）符合美國(guó)環(huán)境保護(hù)署、世界衛(wèi)生組織對(duì)用于自來(lái)水及中國(guó)對(duì)用于飲用水中的 Cu2+的限量要求，同時(shí)，與比色法相比（表1），具有更低檢測(cè)限。這些結(jié)果表明，該CDs有望作為一種Cu2+的快速現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的有效工具。

2.4 選擇性

為了研究該檢測(cè)方法的選擇特異性，選擇了六種其他金屬離子進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果如圖4所示，在相同條件下，Cu2+引起的熒光信號(hào)明顯高于Ag+、Ca2+、Mn2+、Na+、K+和Mg2+引起的信號(hào)變化?？梢姡珻Ds對(duì)Cu2+具有較強(qiáng)的固有特異性，故只有Cu2+才能誘導(dǎo)出顯著的熒光信號(hào)，而 Ag+、Ca2+、Mn2+、Na+、K+和Mg2+只引起微弱的熒光信號(hào)變化。因此，該方法對(duì)Cu2+的檢測(cè)具有良好的選擇特異性，表明其在復(fù)雜樣品分析中的應(yīng)用具有潛在的可能性。

2.5 水樣分析

表2 自來(lái)水中Cu2+加標(biāo)回收檢測(cè)結(jié)果Table 2 detection of Cu2+ in tap water

為了進(jìn)一步驗(yàn)證所制備的 CDs在檢測(cè)實(shí)際樣本中的可行性，對(duì)自來(lái)水進(jìn)行了Cu2+的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，使用本實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定三種不同濃 Cu2+（50、30、10 μmol/L）的回收率（表2），回收率在102.40%～ 107.62%之間，驗(yàn)證了該方法可應(yīng)用在水質(zhì)中Cu2+的定量檢測(cè)。

3 結(jié)論

利用海藻酸鈉作為碳源、色氨酸為氮源，制備了高熒光效應(yīng)的氮摻雜碳量子點(diǎn)，該碳量子點(diǎn)具有優(yōu)異的水溶解度和生物相容性，測(cè)得其熒光量子產(chǎn)率為33.27%，同時(shí)，與其他修飾熒光探針的Cu2+檢測(cè)方法相比，該方法具有超短的檢測(cè)時(shí)間、較低的靈敏性（5.48 μmol/L）和較高的選擇特異性等優(yōu)勢(shì)，同時(shí)也降低了檢測(cè)成本和方法的復(fù)雜性。該方法將 Cu2+、MES buffer、CDs溶液在室溫下簡(jiǎn)單混合即可實(shí)現(xiàn)Cu2+的即時(shí)檢測(cè)。此外，該方法能夠準(zhǔn)確檢測(cè)出實(shí)際食品樣品中Cu2+的含量，并已成功應(yīng)用于水樣中Cu2+的檢測(cè)，因此，為檢測(cè)水體、農(nóng)田等環(huán)境以及農(nóng)作物、葡萄酒等食品中的Cu2+增加可能性，有望為食品安全領(lǐng)域重金屬的檢測(cè)控制提供新的工具，在食品安全領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，同時(shí)，具有高時(shí)效性、高準(zhǔn)確性、高穩(wěn)定性、低成本、低檢測(cè)要求的特點(diǎn)，符合當(dāng)前食品重金屬安全監(jiān)管的需求。