魏鑫悅，陳克保，關(guān)統(tǒng)偉

（西華大學食品與生物工程學院，四川成都 610039）

氧化是生物產(chǎn)生能量的重要過程，然而，人體在代謝過程中會不可避免地產(chǎn)生自由基，自由基容易誘發(fā)各種病理效應(yīng)，如動脈粥樣硬化和衰老[1]。只有體內(nèi)的自由基處于一定的動態(tài)平衡時，才能維持機體運行，因此有必要開發(fā)和利用有效的抗氧化劑來消除人體內(nèi)的自由基[2]。糖尿病是一種以高血糖為特征的代謝性疾病，可以通過胰島素和口服雙胍類、磺脲類等降糖藥物進行治療[3]。然而，這些治療方式會引起腸道紊亂、低血糖等副作用[4]。因此，尋找副作用更少的有效替代品迫在眉睫。

多糖是生物活性大分子，同時也是松露的重要成分之一，對生物細胞無毒副作用，具有多種生物活性，如抗氧化活性[5]、降血糖活性[6]、抗炎活性[7]、免疫調(diào)節(jié)[8]、降血脂[9]等。有研究證實松露多糖的抗氧化能力取決于多糖的分子量、硫酸酯化含量、分支度和糖苷鍵類型[10,11]，其降血糖活性則與多糖的分子量、糖苷鍵、高級結(jié)構(gòu)、基團、硫酸酯化、羧甲基化以及乙酰化密切相關(guān)[12]。黑松露也稱“黑鉆石”，是一種藥食兩用的野生型真菌，具有濃烈而獨特的香味，常作為食品和香料的原料[13]。成熟的黑松露具有較高的營養(yǎng)價值，富含氨基酸、維生素、甾醇和微量元素等，也可以通過增強免疫力、益胃、抑制腫瘤等多種途徑促進人體健康[14,15]。然而不同品種和不同地理環(huán)境的松露，其多糖成分在結(jié)構(gòu)和生物活性方面存在一定程度的差異，從而影響其營養(yǎng)和生物活性。本論文以攀枝花黑松露多糖為研究對象，探索其結(jié)構(gòu)及其抗氧化、降血糖活性，為攀枝花黑松露及其多糖的深度開發(fā)提供理論及科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

本研究中黑松露采自四川省攀枝花市鹽邊縣新九鄉(xiāng)山區(qū)，40 ℃烘干處理，粉碎后過80目篩，得到黑松露粉。

實驗中所用主要試劑有：無水乙醇、濃硫酸、苯酚、3,5-二硝基水楊酸、D-葡萄糖醛酸、α-葡萄糖苷酶、對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷、α-淀粉酶、維生素C、TPTZ、阿卡波糖等，均為常規(guī)國產(chǎn)分析純試劑，購于成都迪維樂普科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Acquity UPLC H-Class超高效液相色譜儀-示差檢測器，Waters；TSK-GEL G4000PWXL凝膠色譜柱，TOSOH；COXEM EM30Plus掃描電鏡，韓國庫塞姆公司；I3X多功能酶標儀，美谷（上海）分子儀器有限公司；Nicolet 380傅里葉變換紅外光譜儀，美國賽默飛公司；其余均為通用設(shè)備。

1.3 實驗方法

1.3.1 黑松露粗多糖的提取

取20 g研磨后的松露粉末，加20倍水混勻，80 ℃熱水浴提取2 h后用布氏漏斗抽濾，收集濾液；60 ℃下進行減壓濃縮后加入4倍體積的95%乙醇于4 ℃沉淀中過夜，在4000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心10 min，收集沉淀，得到粗多糖。

1.3.2 粗多糖的純化

將粗多糖溶解后，按體積比5:1的比例加入Sevage試劑，充分搖勻后在4000 r/min下離心5 min，收集位于上層的糖液，去除蛋白。將多糖凍干后配制成濃度為10 mg/mL的溶液，用葡聚糖凝膠Sephadex G-200層析柱純化，每次的上樣體積為1 mL，用蒸餾水洗脫，流速6 s/滴，1 min/管。將收集的各管糖液按苯酚硫酸法測OD490，根據(jù)試管標號和OD490繪制洗脫曲線，并且得到凍干粉，備用。

1.3.3 多糖純度鑒定

參考于曉鳳[16]的方法對多糖樣品進行純度鑒定。取3.0 mL濃度為1 mg/mL的多糖溶液，以蒸餾水作空白對照，在190～400 nm波長下對攀枝花黑松露純多糖進行全波長掃描。觀察260 nm和280 nm兩處是否存在特征吸收峰，從而判斷純化后的多糖是否含有蛋白質(zhì)和核酸。

1.3.4 黑松露多糖的結(jié)構(gòu)分析

1.3.4.1 分子量測定

分子量測定參照王海燕等[7]的研究，用凝膠色譜對黑松露的分子量分布進行測定。將葡聚糖標準品T-10、T-40、T-70、T-500、T-2000用KH2PO4配成1.0 mg/mL的標準液，同時上樣量為20 μL，測定出峰時間。以葡聚糖標準品的分子量對數(shù)值logMW為橫坐標，以分子量的微分分布dwt/d(logM)為縱坐標，繪制分子量標準曲線。

1.3.4.2 傅立葉紅外光譜分析

精確稱取1 mg多糖樣品，加適量的干燥KBr粉末，混合研磨均勻后，在壓片機上進行壓片，制成透明薄片。將制好的壓片利用傅里葉變換紅外光譜儀掃描，掃描范圍為400～4000 cm-1，采集樣品的紅外吸收光譜。

1.3.4.3 單糖組成分析

參考向瑩等[17]的方法，并做適當處理：在試管中加入400 μL的混合單糖標準液或多糖水解液、400 μL PMP甲醇溶液，使用渦旋混合器混合均勻；放入70 ℃的水浴中反應(yīng)2 h后取出并冷卻至室溫，加400 μL 0.3 mol/L的HCl中和（pH 6～7），再加水1200 μL和等體積的氯仿，使用渦旋混合器混合均勻；放置一段時間，棄掉氯仿相，重復(fù)萃取幾次。將水相用微孔膜（0.45 μm）進行過濾，打入高效液相色譜進行分析。

1.3.4.4 掃描電子顯微鏡分析

參考 Fan等[18]的方法對攀枝花黑松露多糖進行掃描電鏡分析。將充分干燥的多糖樣品固定在樣品臺上，在濺射一層金后，對樣品進行檢查并放入掃描電鏡內(nèi)觀察樣品形態(tài)和結(jié)構(gòu)（放大倍數(shù)為1000倍、4300倍）。

1.3.5 黑松露多糖的抗氧化活性

1.3.5.1 DPPH自由基清除能力

分別取不同濃度的樣品100 μL置于96孔板中，再分別加入15 μL的0.4 mmol/L DPPH，混勻，避光放置30 min，使其充分反應(yīng)，在517 nm波長下測吸光度A1；用乙醇代替DPPH重復(fù)上述操作，在517 nm波長下測吸光度A2，用水做空白對照得吸光度A0，并以維生素C做陽性對照，實驗設(shè)置3組重復(fù)。DPPH自由基清除能力計算公式為：

1.3.5.2 羥自由基清除率

將多糖樣品配置成不同濃度（0.01～0.30 mg/mL）的樣品溶液，依次加入2.5 mL亞硫酸鐵（9 mmol/L）、1 mL水楊酸-乙醇溶液（9 mmol/L）、1 mL過氧化氫（9 mmol/L），在37 ℃水浴中反應(yīng)30 min后，4000×g離心10 min，于520 nm處測吸光度值B。用乙醇代替水楊酸-乙醇溶液得吸光度值B0，用水做空白對照得吸光度值A(chǔ)，并以維生素C做陽性對照，實驗設(shè)置3組重復(fù)。羥自由基的清除能力計算公式為：

1.3.5.3 鐵還原抗氧化能力測定

取不同濃度的樣品（0.1～1.2 mg/mL）100 μL，依次加入400 μL濃度為0.3 mol/L醋酸緩沖液（pH=3.6）、40 μL濃度為10 mmol/L的TPTZ溶液、40 μL濃度為20 mmol/L的三氯化鐵溶液，混合均勻，37 ℃水浴10 min，于590 nm處測定吸光度值。以不同濃度的七水合硫酸亞鐵為標準品重復(fù)上述操作，同時以七水合硫酸亞鐵濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，y=0.6126x+0.4934（R2=0.9966），計算樣品抗氧化能力，實驗設(shè)置3組重復(fù)，并以維生素C做陽性對照。

1.3.6 黑松露多糖的降血糖活性

黑松露多糖的降血糖活性實驗參照等Lv等[19]的研究，并做適當修改。

α-淀粉酶抑制活性測定：將多糖樣品配置成不同濃度（0.5～3.0 mg/mL）的樣品溶液；用pH 6.5的磷酸鹽緩沖液配制0.6 mg/mL的α-淀粉酶溶液和2.0 mg/mL的淀粉溶液。取 100 μL 樣品溶液加入100 μLα-淀粉酶溶液和淀粉溶液，于37 ℃培養(yǎng)20 min后加入500 μL DNS沸水浴5 min，在535 nm處測得吸光度A1。用磷酸緩沖液代替待測溶液，測得吸光度A2；以蒸餾水和磷酸鹽緩沖液分別取代待測液和α-淀粉酶溶液，測的吸光度為A0、A3。實驗設(shè)置 3組重復(fù)，α-淀粉酶抑制能力的公式為：

α-葡萄糖苷酶抑制活性測定：配制不同濃度的（0.5～3.0 mg/mL）的樣品溶液；用pH 6.8的磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L）配制0.01 mg/mL的α-葡萄糖苷酶溶液；配制2.5 mmol/L的pNPG溶液、0.1 mol/L的碳酸鈉溶液。取100 μL樣品溶液加入等體積的α-葡萄糖苷酶溶液，37 ℃水浴15 min，加100 μL的pNPG溶液，37 ℃水浴10 min，最后加入5 mL碳酸鈉溶液使其停止反應(yīng)，于410 nm處測得吸光度值A(chǔ)1。用蒸餾水做空白對照得吸光度值A(chǔ)0；用磷酸鹽緩沖液代替α-葡萄糖苷酶溶液，得到吸光度值B，同時以阿卡波糖做陽性對照。實驗設(shè)置3組重復(fù)，α-葡萄糖苷酶抑制能力的公式為：

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Excel進行實驗數(shù)據(jù)處理，Origin 2018軟件作圖，IBM SPSS Statistics 26軟件計算抗氧化活性和降血糖活性的半抑制濃度（IC50值）。方差分析采用Dunnett檢驗，以p＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 多糖的提取與純化

本試驗表明攀枝花黑松露粗多糖得率為4.52%，這比較于張存艷等[20]采用干燥方式測多糖的得率（7.56%）有所降低，這可能是由于地理位置、干燥方法以及提取方法的差異導(dǎo)致。將所得粗多糖經(jīng)葡聚糖凝膠Sephadex G-200層析柱純化，繪制洗脫曲線（圖1），收集主要出峰的43～45管糖液，濃縮、干燥后得到純化的黑松露多糖。

2.2 多糖純度鑒定結(jié)果

由紫外吸收掃描圖（圖2）可知，該多糖在260 nm與280 nm處無吸收峰，說明純化后的多糖不含蛋白與核酸，該多糖純化徹底。

2.3 分子量

凝膠滲透色譜（Gel Permeation Chromatography，簡稱 GPC）是根據(jù)相對分子量的大小將聚合物中不同的分子進行分離，分子量越小保留時間就越長，具有方便易檢測等優(yōu)點，可用于多糖分子量的測定。本實驗中測得的攀枝花黑松露的數(shù)均分子量Mn為1.29×104u，該分子量的多糖還未有報道。

2.4 傅立葉紅外分析

傅立葉紅外變換光譜圖是分子中基團振動能級躍遷而產(chǎn)生的。根據(jù)攀枝花黑松露多糖的紅外光譜圖（圖4）可知：該多糖在3404.81 cm-1處有吸收峰，是由O-H伸縮振動所引起[21]；在2927.41 cm-1處的吸收峰，說明有C-H存在[22]；在1641.63 cm-1的吸收峰，可能是由于C=O的不對稱伸縮而引起的振動所導(dǎo)致；在1419.83 cm-1處的吸收峰，這是由于 C-H 變角振動引起[23]；1200～1000 cm-1的吸收峰可能是吡喃環(huán)伸縮振動所引起的，同時也是多糖的典型吸收區(qū)域[24]。此外，該多糖的紅外掃描結(jié)果在578.51 cm-1處還有吸收峰，表明該黑松露多糖中糖苷鍵為α-型，且在糖醛酸對應(yīng)的1740 cm-1沒有吸收峰，說明該黑松露多糖不含糖醛酸，即為中性糖[25]。

2.5 單糖組成

黑松露多糖經(jīng)過水解以后，采用衍生法對多糖進行衍生化，黑松露多糖帶上共軛基團后在紫外區(qū)有吸收峰，然后使用高效液相色譜分析[26]。攀枝花黑松露主要是由甘露糖、葡萄糖、鼠李糖、半乳糖組成，這四種單糖的摩爾比為 2.89:1.81:0.34:0.50，其中甘露糖含量最大，其次是葡萄糖。有研究表明，多糖的單糖組成會影響其高級結(jié)構(gòu)，大部分具有降血糖功能的多糖都含有葡萄糖、半乳糖[15]。

2.6 掃描電子顯微鏡分析

該多糖組分的表面形態(tài)如圖6所示。在放大1000倍電鏡下（圖 5a）觀察到該多糖呈塊狀堆積結(jié)構(gòu)，放大4300倍（圖5b）呈瘤狀突起形態(tài)。

2.7 黑松露多糖的抗氧化活性

DPPH自由基是一種穩(wěn)定的氮中心的自由基，其有機溶液呈紫色，溶液的變色程度與其接受的電子數(shù)量（自由基清除活性）成定量關(guān)系，因而可以用于評價抗氧化活性[27]。通過圖7a可知，黑松露多糖具有清除DPPH自由基和羥自由基的能力，但清除作用低于對照維生素C。在一定的濃度范圍內(nèi)，清除自由基的能力隨著多糖溶液濃度的增大而增大，并且這一趨勢與維生素C相同。在濃度為3 mg/mL時，該多糖對DPPH自由基和羥自由基的清除率是最大的，分別為64.29%和52.42%。

FRAP是一種基于氧化還原反應(yīng)的比色法。在酸性條件下，F(xiàn)e3+-TPTZ被抗氧化劑還原成Fe2+-TPTZ，溶液變成深藍色，并且在593 nm處有強吸收。由圖7b可知該多糖的鐵還原能力與濃度有依賴關(guān)系，在一定范圍內(nèi)隨著多糖濃度的增大鐵還原能力也會隨之增強。

多糖的抗氧化活性與它的化學結(jié)構(gòu)有著密切聯(lián)系。例如，Liu等[28]從松露中提取出TP1、STP1和STP2三個組分中主要的單糖都是葡萄糖，這些組分都具有較強的抗氧化性能。本研究測定了攀枝花黑松露的單糖組成，發(fā)現(xiàn)其也主要由葡萄糖組成，也表現(xiàn)出較強的抗氧化性，這與上述研究一致。

通過計算，得到該多糖清除DPPH自由基和羥自由基的IC50值分別為1.02 mg/mL、1.82 mg/mL，Vc清除 DPPH自由基和羥自由基的 IC50值分別為 0.17 mg/mL、0.62 mg/mL。該多糖清除DPPH自由基的能力要強于清除羥自由基的能力。

2.8 黑松露多糖的降血糖活性

多糖類物質(zhì)可以通過調(diào)控相關(guān)消化酶活性、調(diào)節(jié)肝臟糖代謝中關(guān)鍵酶表達等途徑達到降血糖作用[15]。攀枝花黑松露多糖對α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶均有一定的抑制作用，其抑制作用隨濃度的變化趨勢與阿卡波糖一致（圖8）。且該黑松露多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制作用強于對α-淀粉酶的抑制作用。在 2.5 mg/mL時對α-淀粉酶的抑制作用最大，達到 45.80%；在 2 mg/mL時對α-葡萄糖苷酶的抑制作用趨于穩(wěn)定，達到57.22%。

曾有研究表明，多糖的降血糖活性與其分子質(zhì)量、單糖組成相關(guān)，一般在合適的范圍內(nèi)，分子量越低的多糖組分對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制效果越高[17]。有時，降血糖能力的強弱也與多糖的來源相關(guān)[19]，如邵淑宏等[29]的研究中測定了三種烏龍茶多糖，其中分子量最大的多糖具有最強的α-葡萄糖苷酶抑制效果。測定該多糖與阿卡波糖抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶IC50值：多糖的IC50值分別為1.99 mg/mL、3.30 mg/mL，阿卡波糖的IC50值分別為0.90 mg/mL、0.76 mg/mL。故黑松露多糖具有一定的降血糖能力，但與阿卡波糖相比，抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶較弱。

3 結(jié)論

本研究在對黑松露多糖的結(jié)構(gòu)分析中發(fā)現(xiàn)，該組分具有糖類化合物的特征峰，且推斷出該多糖為α-吡喃型雜多糖，其分子量為1.29×104u，主要由甘露糖、葡萄糖、鼠李糖和半乳糖組成，摩爾比為2.89:1.81:0.34:0.50?？寡趸徒笛墙Y(jié)果表明，該多糖具有較好的抗氧化和降血糖活性，且隨質(zhì)量濃度的增加其清除率和抑制率逐漸升高，其中對DPPH自由基的清除能力最好。黑松露多糖作為天然的抗氧化劑，在健康食品的開發(fā)和生產(chǎn)中具有一定的研究意義。同時，隨著對多糖研究的不斷深入，黑松露多糖較好的降血糖活性也將為其深度開發(fā)及其在輔助治療糖尿病方面提供更好的健康解決途徑。