張春雷，吳新玉，王棟，陸倩，董莉，張金娟，廖尚高

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，省部共建藥用植物功效與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴安新區(qū) 550025；2.貴州醫(yī)科大學(xué)民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心/貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽 550004；3.貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴安新區(qū) 550025)

肝纖維化是指由化學(xué)毒物性損傷、慢性肝炎病毒感染、自身免疫性肝病、酗酒等因素引起的以肝內(nèi)結(jié)締組織非正常增生為主要特征的病理生理過程[1]。中藥治療肝纖維化具有療效高、低毒副反應(yīng)、費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)，逐漸得到人們的重視[2]。TGF-β1/Smad信號通路在肝纖維化的發(fā)生及發(fā)展中具有重要作用，調(diào)控層粘連蛋白(laminin，LN)、透明質(zhì)酸(hyaluronic acid，HA)及羥脯氨酸等蛋白的表達(dá)，最終導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生與進(jìn)展[3]。α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)是肝纖維化活化的標(biāo)志物，Ⅰ型膠原蛋白(Collagen I)主要反映肝纖維化程度[4]。大王馬先蒿(PedicularisrexC.B.，PR)為玄參科(Scrophulariaceae)馬先蒿屬(Pedicularis)植物，臨床上用于慢性肝炎、肝硬化腹水等癥的治療[5-6]，現(xiàn)代研究表明，大王馬先蒿的化學(xué)成分主要為苯丙素、環(huán)烯醚萜、黃酮等[7]。基于肝纖維化是肝硬化的早期階段，筆者推測對肝硬化或肝硬化腹腔積液有療效的藥物可能對肝纖維化有效。因此，本研究擬進(jìn)一步通過建立四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型，探討大王馬先蒿對CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化體內(nèi)作用，為大王馬先蒿抗肝纖維化的臨床應(yīng)用及相關(guān)藥物的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1動物 清潔級昆明小鼠，60只，雄性，體質(zhì)量(20±2) g，由貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號SCXK(黔)2018-0001；自由飲水，光照12 h/黑暗12 h，溫度18～22 ℃，相對濕度50%～60%條件下飼養(yǎng)，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于正式實(shí)驗(yàn)。

1.2藥物和試劑 大王馬先蒿(PedicularisrexC.B.Clark，PR)全株，經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院龍慶德副教授鑒定(批號：201910)。秋水仙堿(批號：S15A8C34051)購自上海源葉生物科技有限公司；CCl4(批號：L1602077)購自阿拉丁工業(yè)公司，臨用前用橄欖油稀釋；TGF-β1(批號：ab179695)，α-SMA(批號：ab124964)均購自美國Abcam公司，Smad3(批號：L1602077)，Collagen I(批號：10423R)均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，GAPDH(批號：T0004)購自美國Affinity公司；天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)檢測試劑盒(批號分別為20200109，20200110)購自南京建成生物工程研究所；透明質(zhì)酸(HA)酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(ELISA Kits)(批號：B16011450)，層粘蛋白(LN)酶聯(lián)免疫試劑盒(ELISA Kits)(批號：A22011449)購自武漢華美生物工程有限公司，PC-Ⅲ ELISA Kits (批號：L210104920)，IV-C ELISA Kits (批號：L210104913)購自武漢云克隆科技股份有限公司；4%多聚甲醛組織固定液(批號：69111800)購自Biosharp 公司。

1.3儀器 全波段多功能酶標(biāo)儀(美國 Bio-Tek 公司，型號：ELX800)；移液器(德國 Eppendorf 股份公司，型號：P13199E)； XH-B 型旋渦混合器(江蘇康健醫(yī)療用品有限公司)；K30 型干式恒溫器(杭州奧盛儀器有限公司)；CP124C 型電子天平[奧豪斯儀器(常州)有限公司，感量：0.1 mg]；Centrifuge 5810R 型高速冷凍離心機(jī)(美國 Eppendorf 公司)；HK-UP-20 分析型超純水機(jī)(合肥宏科科技有限公司)；SIM-F140AY65 雪花制冰機(jī)(日本三洋電機(jī)株式會社)。

1.4藥材提取 大王馬先蒿樣品制備：稱取大王馬先蒿2 kg，第1次加95%乙醇提取2 h濾過，第2次加95%乙醇提取1 h，濾過，合并濾液，濃縮至浸膏備用。

1.5造模、分組及給藥[8]將60只雄性昆明小鼠隨機(jī)分為正常對照組、模型對照組、秋水仙堿組[9]及大王馬先蒿小、中、大劑量組，每組10只；大王馬先蒿組給藥劑量設(shè)置依據(jù)該藥臨床劑量(每天15～30 g)[10]，選擇每天26 g的臨床劑量換算成小鼠等效劑量小劑量[200 mg·kg-1，0.1 mL·(10 g)-1]，再依次得出中劑量[400 mg·kg-1，0.1 mL·(10 g)-1]與大劑量[800 mg·kg-1，0.1 mL·(10 g)-1]。除正常對照組外，其余各組小鼠按照文獻(xiàn)[11]方法均腹腔注射經(jīng)橄欖油稀釋的CCl4溶液(1 mL·kg-1)造模，每周2次，連續(xù)12周，正常對照組腹腔注射等體積橄欖油；實(shí)驗(yàn)第5周，秋水仙堿組灌胃0.1 mg·kg-1秋水仙堿，大王馬先蒿小、中、大劑量組分別灌胃200，400，800 mg·kg-1大王馬先蒿提取物，正常對照組和肝纖維化模型對照組灌胃給予等體積0.5%羧甲基纖維素鈉；每天1次，持續(xù)至第12周結(jié)束，期間密切觀察小鼠外表，活動狀態(tài)。

1.6血清中ALT、AST、HA、LN、PCⅢ及Ⅳ-C水平檢測 末次給藥1 h后，使用水合氯醛麻醉小鼠，眼球取血，待室溫沉降2 h后，3000 r·min-1離心15 min(r=5 cm)，分離血清，按照試劑盒說明書中的操作方法，檢測大王馬先蒿對肝纖維化小鼠血清AST、ALT、HA、LN、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)及Ⅳ型膠原(Ⅳ-C)水平的影響。

1.7肝組織TGF-β1，Smad3，α-SMA及Collagen I表達(dá)檢測 小鼠取血后迅速在冰盤上取出肝組織，稱取固定部位的肝組織100 mg，經(jīng)預(yù)冷的0.9%氯化鈉溶液漂洗沖去表面血液及濾紙拭干后，加入RIPA細(xì)胞裂解液，置于冰水浴中進(jìn)行裂解(20 min)，然后離心(10 000 r·min-1，15 min，r=5 cm)[12]；二喹啉甲酸(BCA)法測蛋白濃度。取等量蛋白(10 μg)行10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，常規(guī)方法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、封閉后，加入TGF-β1(1：1000)，Smad 3(1：1000)，α-SMA(1：1500)及Collagen I(1：500)一抗，4 ℃冰箱過夜后室溫孵育1 h；經(jīng)緩沖液TBST洗膜后(10 min×3次)，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體(二抗)，繼續(xù)室溫孵育1 h后，TBST洗膜(10 min×3次)，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯影。采用圖像分析軟件分析各條帶吸光度值，通過目的條帶吸光度與內(nèi)參(GAPDH)吸光度的比值進(jìn)行半定量分析。

1.8蘇木精-伊紅(HE)，馬松(Masson)染色 實(shí)驗(yàn)時取肝組織放入4%多聚甲醛中，后經(jīng)乙醇脫水、石蠟包埋等步驟后，行連續(xù)切片后封閉。常規(guī)方法進(jìn)行HE和Masson染色，鏡下觀察肝組織病理形態(tài)。

2 結(jié)果

2.1大王馬先蒿對肝纖維化小鼠一般狀態(tài)的影響 實(shí)驗(yàn)開始前，各組小鼠精神狀態(tài)好，活動能力強(qiáng)，毛色白，有光澤。隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)展，由CCl4誘導(dǎo)的模型對照組小鼠出現(xiàn)形體消瘦，皮毛豎立，欠光澤，活動減少，反應(yīng)遲緩，攝食量減少。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時，正常對照組毛色光澤，飲食如常，活潑好動；模型對照組小鼠明顯出現(xiàn)食欲減退，形體瘦弱，體質(zhì)量減輕，豎毛，毛色略暗，反應(yīng)略顯遲緩，呈現(xiàn)疾病狀態(tài)；秋水仙堿組、大王馬先蒿小、中、大劑量組小鼠，活動頻率如常，攝食一般。取肝臟組織后觀察發(fā)現(xiàn)，正常對照組肝臟表面光滑，透亮，無異常；模型對照組肝臟與周圍組織粘連明顯，邊緣圓頓，質(zhì)地硬，肝臟表面呈彌漫的細(xì)小結(jié)節(jié)伴有淡黃色腹水；大王馬先蒿小、中、大劑量組和秋水仙堿組的情況對比模型對照組有所減輕。

2.2大王馬先蒿對肝纖維化小鼠肝臟和脾臟指數(shù)的影響 通過稱量小鼠的體質(zhì)量、肝臟和脾臟的質(zhì)量，按照公式：臟器系數(shù)=臟器質(zhì)量/小鼠體質(zhì)量×100%計算，本實(shí)驗(yàn)采用肝臟指數(shù)，脾臟指數(shù)進(jìn)行比較。肝臟受到損傷越重肝臟指數(shù)越高。和正常對照組小鼠肝指數(shù)和脾指數(shù)比較，模型對照組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。秋水仙堿組和大王馬先蒿小、中、大劑量組小鼠的肝指數(shù)和脾指數(shù)相比模型對照組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。秋水仙堿組與大王馬先蒿各劑量組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 大王馬先蒿對肝纖維化小鼠臟器指數(shù)的影響 Tab.1 Effect of Pedicularis rex on organ index in liver fibrosis mice

2.3大王馬先蒿對肝纖維化小鼠血清ALT、AST、HA、LN、PCⅢ及Ⅳ-C水平的影響 與正常對照組比較，肝纖維化模型對照組小鼠血清 HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C、AST及ALT 水平升高 (P<0.01)，提示造模成功；與肝纖維化模型對照組小鼠比較，小、中、大劑量大王馬先蒿組與秋水仙堿組小鼠血清HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C、AST、ALT水平均降低 (P<0.01)，大王馬先蒿大劑量組血清HA水平與藥秋水仙堿組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，其余各組無明顯差異。見表 2。

表2 大王馬先蒿對肝纖維化小鼠血清HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C、ALT和AST水平的影響 Tab.2 Effect of Pedicularisrex on serum HA, LN, PCⅢ, Ⅳ-C, ALT and AST levels in liver fibrosis mice

2.4大王馬先蒿對CCl4性肝纖維化小鼠肝臟病理變化的影響 采用HE和Masson染色進(jìn)行觀察，正常對照組肝組織結(jié)構(gòu)清晰，肝小葉完整，肝細(xì)胞索排列整齊，以中央靜脈為中心呈放射狀排列，匯管區(qū)僅有少量的纖維組織。肝纖維化模型對照組小鼠部分肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，有脂肪空泡、大量炎癥細(xì)胞浸潤，并有假小葉形成，肝細(xì)胞普遍壞死，膠原纖維大量增生并形成纖維間隔。秋水仙堿組肝纖維化情況有所好轉(zhuǎn)，肝細(xì)胞索排列基本整齊，見少量的纖維間隔形成，肝細(xì)胞壞死減少，脂肪空泡減少，炎癥減輕，在匯管區(qū)觀察少量纖維組織增生。大王馬先蒿小、中、大劑量組與模型對照組相比，肝纖維化的現(xiàn)象有所好轉(zhuǎn)，匯管區(qū)膠原纖維增生減少，纖維間隔變窄，肝細(xì)胞壞死程度減輕，脂肪空泡減少，炎癥細(xì)胞浸潤減少，見圖1，2。

2.5大王馬先蒿對CCl4誘導(dǎo)肝纖維化小鼠肝組織TGF-β1/Smad3信號通路，α-SMA及Collagen I表達(dá)的影響 與正常對照組比較，肝纖維化模型對照組小鼠肝組織 TGF-β1、Smad3、α-SMA及Collagen I表達(dá)增加 (P<0.01)；與肝纖維化模型對照組小鼠比較，小、中、大劑量的大王馬先蒿組小鼠肝組織TGF-β1、Smad3、α-SMA及Collagen I蛋白表達(dá)均降低 (P<0.01)，大王馬先蒿大劑量組與秋水仙堿組比較，Smad3及α-SMA表達(dá)水平較秋水仙堿組顯著降低(P<0.01)。見圖3、表3。

表3 大王馬先蒿對肝纖維化小鼠肝組織TGF-β1，Smad3，α-SMA及Collagen I表達(dá)的影響 Tab.3 Effect of Pedicularisrex on the expressions of TGF-β1, Smad3, α-SMA and collagen I in liver tissue of liver fibrosis mice

A.正常對照組；B.模型對照組；C.秋水仙堿組；D.大王馬先蒿小劑量組；E.大王馬先蒿中劑量組；F.大王馬先蒿大劑量組。圖1 大王馬先蒿對肝纖維化小鼠肝臟病理組織學(xué)的影響(HE，×200)A.normal control group；B.model control group；C.colchicine group；D.Pedicularis rex low-dose group；E.Pedicularis rex medium-dose group；F.Pedicularis rex high-dose group.Fig.1 Effect of Pedicularis rex on liver histopathology in liver fibrosis mice(HE，×200)

圖3 Western blotting檢測各組 TGF-β1、Smad3、α-SMA及Collagen I蛋白表達(dá)Fig.3 Expressions of TGF-β1, Smad3, α-SMA and collagen I proteins detected by Western blotting

3 討論

肝纖維化是肝臟受到各種慢性炎癥損傷時，肝細(xì)胞外基質(zhì)異常分泌并沉積的可逆性創(chuàng)傷修復(fù)過程。腹腔注射CCl4出現(xiàn)肝損傷或壞死，從而導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生。通過CCl4誘導(dǎo)建立的肝纖維化動物模型，其肝組織在形態(tài)學(xué)、病理生理學(xué)等方面與人類肝纖維化相似。因此，用CCl4誘導(dǎo)動物肝纖維化模型，已被廣泛應(yīng)用于防治肝纖維化藥物篩選及其作用機(jī)制的研究[13]。當(dāng)肝功能受損時，可引起肝細(xì)胞損傷，細(xì)胞膜通透性增加，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ALT、AST滲出進(jìn)入血液，使其血液濃度明顯增加[14]，AST和ALT是肝功能損傷最敏感的指標(biāo)。另一方面，由于HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C參與ECM合成，是肝組織正常結(jié)構(gòu)被破壞的重要因素，肝纖維化過程常伴有肝細(xì)胞受損和HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C水平明顯升高，檢測血清中這4種指標(biāo)可準(zhǔn)確、靈敏地反映肝內(nèi)纖維生成的情況，是臨床診斷肝纖維化的敏感指標(biāo)[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大王馬先蒿可以有效降低肝纖維化模型小鼠血清中HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C、AST和ALT水平，表明大王馬先蒿具有保護(hù)肝臟免受損傷，降低肝纖維化的作用。另外，肝組織病理變化也說明大王馬先蒿給藥組減少了CCl4引起的膠原纖維增生和肝細(xì)胞變性，減少了肝臟切片中炎性細(xì)胞分布。另外，與CCl4誘導(dǎo)的模型對照組相比，大王馬先蒿給藥組還可降低小鼠的肝臟和脾臟指數(shù)，減輕臟器的腫脹及脂質(zhì)化程度。以上結(jié)果都表明大王馬先蒿對CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠具有較好的保護(hù)作用。

TGF-β1通過激活肝星狀細(xì)胞(HSC)和成纖維細(xì)胞生成細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)蛋白，是肝纖維化過程中的關(guān)鍵介質(zhì)[16]。而Smad蛋白可將TGF-β1信號由細(xì)胞漿轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核，從而調(diào)控LN、HA及羥脯氨酸等蛋白的表達(dá)，最終導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生與進(jìn)展[17-18]。此外，α-SMA被認(rèn)為是肝纖維化標(biāo)志物、Ⅰ型膠原蛋白及Ⅲ型膠原蛋白反映了肝纖維化程度，并參與一系列炎癥和纖維化的過程[19]。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，灌胃給予肝纖維化模型小鼠小、中、大劑量大王馬先蒿后，模型小鼠肝組織TGF-β1、Smad 3、α-SMA及Collagen I蛋白表達(dá)水平明顯降低。這些結(jié)果表明，大王馬先蒿對CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠的保護(hù)作用可能與抑制TGF-β1/Smad信號通路，進(jìn)而阻止肝星狀細(xì)胞活化，下調(diào)α-SMA和Collagen I蛋白表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，大王馬先蒿對CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠具有較好的保護(hù)作用，該作用與抑制TGF-β1/Smad信號通路及下調(diào)α-SMA和Collagen I蛋白表達(dá)有關(guān)。