梁魏昉

心力衰竭是作為各種器質(zhì)性心臟病的終末階段，發(fā)病率及病死率較高[1-2]，研究表明，免疫炎癥反應(yīng)及炎癥細(xì)胞浸潤為心力衰竭發(fā)生發(fā)展的病理機(jī)制之一，尤其是炎癥反應(yīng)及其造成的血流動力學(xué)紊亂是促進(jìn)心臟重構(gòu)及心功能惡化的重要因素，可作為反映病情進(jìn)展及預(yù)后的獨立預(yù)測因子[3-4]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Toll樣受體(Toll like receptor，TLR)/核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear transcription factors，NF-κB)信號通路介導(dǎo)的免疫炎性反應(yīng)的激活可促進(jìn)動脈粥樣硬化、心肌缺血(再灌注損傷)等心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展[5]。另有研究指出，心力衰竭病人炎癥反應(yīng)引起的血流動力學(xué)異常，血液呈高凝狀態(tài)，其體內(nèi)存在明顯內(nèi)皮功能損傷，且損傷程度與心力衰竭程度一致[6]。血管性血友病因子(von Willebrand factor，vWF)是內(nèi)皮功能損傷標(biāo)志物，D-二聚體(D-dimer，D-D)為機(jī)體交聯(lián)纖維蛋白降解產(chǎn)物，為反映機(jī)體凝血功能的指標(biāo)之一[7-8]?；诖?，本研究觀察心力衰竭病人TLR4/NF-κB信號通路、vWF、D-D水平變化，并探究其與心力衰竭程度、左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)的關(guān)系?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年10月—2020年10月我院收治的128例心力衰竭病人作為研究對象，均符合《中國心力衰竭診斷和治療指南2014》中心力衰竭相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]，并經(jīng)臨床病史、癥狀、體征及實驗室、影像學(xué)等檢查確診。按照美國紐約心臟病協(xié)會(New York Heart Association，NYHA)心功能分級，其中Ⅱ級40例，Ⅲ級56例，Ⅳ級32例。排除標(biāo)準(zhǔn)：①近3個月內(nèi)有較嚴(yán)重創(chuàng)傷或手術(shù)者；②合并腦血管疾病者；③伴有肝腎功能不全者；④合并急慢性感染、慢性阻塞性肺疾病者；⑤合并妊娠、內(nèi)分泌疾病者；⑥心臟起搏器植入者；⑦伴有先天性心臟病、風(fēng)濕性心臟病、心包病變、重度心臟瓣膜病者；⑧超聲心動圖檢查圖像質(zhì)量較差，無法做出準(zhǔn)確判斷者；⑨合并惡性腫瘤者。

1.2 方法

1.2.1 基線資料收集 通過病案系統(tǒng)收集病人入院時臨床資料，包括年齡、性別、體質(zhì)指數(shù)、吸煙、飲酒、合并癥(糖尿病、高血壓、冠心病)、空腹血糖、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)。

1.2.2 血清指標(biāo)檢測 清晨空腹?fàn)顟B(tài)下抽取2 mL肘靜脈血，3 000 r/min離心處理10 min，離心半徑為15 cm，分離血清、血漿，采用凝血儀及其配套試劑盒(日本Syxmex公司生產(chǎn)，CA6000型)以免疫比濁法測定D-D水平；采用全自動生化分析儀及其配套試劑盒(瑞士羅氏E170型)以酶聯(lián)免疫吸附法檢測vWF水平；采用電化學(xué)發(fā)光全自動免疫分析儀(瑞士羅氏Elecsys-2010)測定B型利鈉肽(B-type natriuretic peptide，BNP)、氨基酸末端B型利鈉肽前體(plasma N-terminal pro brain natriuretic peptide，NT-proBNP)，計算BNP/NT-proBNP；以實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)測定外周血單核細(xì)胞TLR4、NF-κB mRNA；由美國Invitrogen公司提供的trizol提取細(xì)胞總RNA，按照試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，RT-qPCR儀(美國ABI公司7300型)擴(kuò)增，采用生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物，同時以RT-qPCR儀器自帶分析軟件獲得各樣本、各基因擴(kuò)增Ct，以β-actin作為內(nèi)參照基因，目的基因表達(dá)相對值RQ=2-△△Ct。操作嚴(yán)格遵循儀器及試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.3 超聲心動圖檢查 采用彩色多普勒超聲診斷儀(PHILIPS5500型)，探頭頻率1～5 MHz，參考美國超聲心動圖指南[10]進(jìn)行測量，以實時三維超聲心動圖采集動態(tài)圖像，脫機(jī)計算LVEF。

2 結(jié) 果

2.1 不同心功能分級心力衰竭病人臨床資料比較 不同心功能分級心力衰竭程度病人年齡、BNP/NT-proBNP、TLR4 mRNA、NF-κB mRNA、vWF、D-D、LVEF相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 不同心功能分級心力衰竭病人臨床資料比較

(續(xù)表)

2.2 TLR4 mRNA、NF-κB mRNA、vWF、D-D、LVEF與心力衰竭嚴(yán)重程度的相關(guān)性 心力衰竭病人TLR4 mRNA、NF-κB mRNA、vWF、D-D與心力衰竭程度呈正相關(guān)(P<0.05)，LVEF與心力衰竭程度呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。詳見表2。

表2 TLR4 mRNA、NF-κB mRNA、vWF、D-D、LVEF與心力衰竭嚴(yán)重程度的相關(guān)性

2.3 TLR4 mRNA、NF-κB mRNA、vWF、D-D與LVEF、BNP/NT-proBNP的相關(guān)性 心力衰竭病人TLR4 mRNA、NF-κB mRNA、vWF、D-D與LVEF呈負(fù)相關(guān)(r=-0.707，P<0.05；r=-0.780，P<0.05；r=-0.728，P<0.05；r=-0.898，P<0.05)，與BNP/NT-proBNP呈正相關(guān)(r=0.644，P<0.05；r=0.618，P<0.05；r=0.609，P<0.05；r=0.831，P<0.05)。詳見圖1～圖8。

圖1 TLR4 mRNA表達(dá)與LVEF的相關(guān)性分析

圖2 NF-κB mRNA表達(dá)與LVEF的相關(guān)性分析

圖3 vWF與LVEF的相關(guān)性分析

圖4 D-D與LVEF的相關(guān)性分析

圖5 TLR4 mRNA表達(dá)與BNP/NT-proBNP的相關(guān)性分析

圖6 NF-κB mRNA表達(dá)與BNP/NT-proBNP的相關(guān)性分析

圖7 vWF與BNP/NT-proBNP的相關(guān)性分析

圖8 D-D與BNP/NT-proBNP的相關(guān)性分析

2.4 心力衰竭病人心力衰竭程度的影響因素分析 以心力衰竭病人心力衰竭程度作為因變量(Ⅱ級賦值為1，Ⅲ級賦值為2，Ⅳ級賦值為3)，將年齡、TLR4 mRNA、NF-κB mRNA、vWF、D-D、LVEF水平作為自變量，納入Logistic回歸分析，自變量賦值：年齡<60歲=0，≥60歲=1；TLR4 mRNA、NF-κB mRNA、vWF、D-D以平均值為界，≤平均值=0，>平均值=1；LVEF以平均值為界，<平均值=0，≥平均值=1。Logistic回歸分析結(jié)果顯示，年齡、TLR4 mRNA、NF-κB mRNA、vWF、D-D、BNP/NT-proBNP、LVEF水平均為心力衰竭病人心力衰竭程度的影響因素(P<0.05)。詳見表3。

表3 心力衰竭病人心力衰竭程度的影響因素分析

2.5 TLR4 mRNA、NF-κB mRNA、vWF、D-D、LVEF對心力衰竭程度的鑒別診斷價值 以ROC曲線獲取TLR4 mRNA、NF-κB mRNA、vWF、D-D、LVEF鑒別診斷心力衰竭程度的AUC，結(jié)果顯示，各指標(biāo)聯(lián)合診斷心功能Ⅲ級、Ⅳ級AUC分別為0.797，0.877，最佳敏感度分別為71.43%、75.00%，特異度分別為82.50%、93.75%。詳見表4及圖9、圖10。

表4 TLR4 mRNA、NF-κB mRNA、vWF、D-D、LVEF對心力衰竭程度的鑒別診斷價值

圖9 各指標(biāo)診斷心力衰竭病人心功能Ⅳ級的ROC曲線

圖10 各指標(biāo)診斷心力衰竭病人心功能Ⅲ級的ROC曲線

3 討 論

TLR作為參與特異性免疫的重要蛋白質(zhì)分子，同時也是連接非特異性與特異性免疫的橋梁，在免疫炎性反應(yīng)中發(fā)揮至關(guān)重要作用[11-12]。TLR4作為TLR家族重要成員之一，現(xiàn)已被作為心腦血管風(fēng)險檢測標(biāo)志物，其在心力衰竭發(fā)生、發(fā)展過程中過度表達(dá)，且其介導(dǎo)的一系列信號傳導(dǎo)通路致使病人心臟功能進(jìn)一步減退[13]。TLR4信號傳導(dǎo)途徑根據(jù)接頭蛋白不同可分為髓細(xì)分化蛋白依賴性與非依賴性途徑，其中依賴性途徑主要引起NF-κB的激活及核轉(zhuǎn)位，并誘導(dǎo)炎癥相關(guān)基因表達(dá)[14-15]。此外，NF-κB激活后還可加速細(xì)胞間黏附分子轉(zhuǎn)錄及受損細(xì)胞間黏附作用，進(jìn)一步擴(kuò)大炎癥反應(yīng)，形成惡性循環(huán)[16-17]。本研究中，TLR4 mRNA、NF-κB mRNA水平與心力衰竭病人心力衰竭程度呈正相關(guān)，分析原因，可能是由于免疫炎性反應(yīng)始終貫穿心力衰竭發(fā)生與發(fā)展全過程，在心力衰竭病變過程中，TLR4/NF-κB信號通路過度激活，會產(chǎn)生大量免疫炎性因子進(jìn)入血液循環(huán)，通過負(fù)性肌力作用，促使心肌細(xì)胞凋亡及心肌成纖維細(xì)胞增殖，加重心力衰竭程度。

有研究指出，TLR4的髓細(xì)分化蛋白依賴途徑可通過引起NF-κB的激活，易位進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，誘導(dǎo)黏附分子、共刺激分子等促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生，加重血管損傷，加之心力衰竭病人血液高凝狀態(tài)可促進(jìn)下游免疫炎性因子對冠狀動脈血管浸潤，加重血管內(nèi)皮損傷[18]，故推測心力衰竭病人TLR4/NF-κB與vWF、D-D水平有關(guān)。

D-D是一種由活化因子ⅩⅢ與纖維蛋白單體與中間聚合體交聯(lián)，經(jīng)纖溶酶水解形成的特異性降解產(chǎn)物，為纖溶過程標(biāo)志物，可調(diào)節(jié)纖溶酶及凝血酶活性變化，反映機(jī)體內(nèi)凝血系統(tǒng)及繼發(fā)性纖溶系統(tǒng)的活性，判斷機(jī)體處于高凝狀態(tài)或纖溶亢進(jìn)狀態(tài)[19-21]。血液中D-D水平越高表明高凝狀態(tài)越嚴(yán)重，進(jìn)而致使機(jī)體心肌組織微循環(huán)障礙及缺氧缺血狀態(tài)加重，造成心肌纖維化、心功能損傷、左心室重構(gòu)等一系列心臟變化，最終導(dǎo)致心力衰竭[22-23]。vWF主要由內(nèi)皮細(xì)胞合成、分泌，生理狀態(tài)下參與止血的主要糖蛋白之一。在病理狀態(tài)下，vWF不僅參與高凝狀態(tài)形成，同時各類病理因素對血管內(nèi)皮的復(fù)雜影響同樣反映在血漿vWF水平變化方面[24-25]。vWF為血管內(nèi)皮損傷因子重要成員，其在結(jié)構(gòu)上包含了多個巰基結(jié)構(gòu)，可通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)，促進(jìn)下游糖蛋白配體激活，從而引起冠狀動脈血管內(nèi)皮損傷，增加血管內(nèi)皮下脂質(zhì)沉積[26]。在血管內(nèi)皮細(xì)胞完整性破壞的過程中，vWF大量釋放，誘導(dǎo)下游單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞激活，增加其對于冠狀動脈內(nèi)皮下平滑肌細(xì)胞浸潤，致使平滑肌細(xì)胞痙攣[27]。已有研究證實，心力衰竭病人vWF水平高于健康對照組[28]，充分說明心力衰竭病人存在凝血功能異常、高凝狀態(tài)及血管內(nèi)皮損傷。基于此，本研究進(jìn)一步分析心力衰竭病人vWF、D-D水平與心力衰竭程度的相關(guān)性，結(jié)果顯示，心力衰竭病人vWF、D-D與心力衰竭程度呈正相關(guān)，考慮原因，可能與心力衰竭病情發(fā)展過程中，免疫炎癥反應(yīng)加劇，血管內(nèi)皮損傷嚴(yán)重，血液持續(xù)處于高凝狀態(tài)有關(guān)。

本研究還顯示，心力衰竭病人TLR4 mRNA、vWF、NF-κB mRNA、D-D與LVEF呈負(fù)相關(guān)，與目前公認(rèn)的判斷心力衰竭嚴(yán)重程度的指標(biāo)BNP/NT-proBNP呈正相關(guān)。心力衰竭病人心臟壓力容量負(fù)荷過重、心肌缺氧缺血及再灌注損傷均可引起心肌細(xì)胞表達(dá)下降，同時β受體下調(diào)也可影響心肌收縮、舒張功能，持續(xù)高度激活腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)與交感神經(jīng)，引起心肌肥厚及心室重構(gòu)。心室重構(gòu)可進(jìn)一步增加心肌損傷程度，進(jìn)行性心肌重塑影響心室壓力負(fù)荷及局部血運障礙，造成LVEF降低，最終導(dǎo)致心室內(nèi)相對瘀滯的高凝狀態(tài)。此外，本研究采用TLR4 mRNA、vWF、D-D、LVEF、NF-κB mRNA判斷心力衰竭病人心力衰竭程度，結(jié)果顯示，上述指標(biāo)聯(lián)合判斷心力衰竭程度AUC最大，故臨床可實時監(jiān)測心力衰竭病人vWF、TLR4 mRNA、NF-κB mRNA、D-D、LVEF水平變化，旨在為臨床治療方案選擇提供依據(jù)。

綜上所述，心力衰竭病人TLR4 mRNA、vWF、NF-κB mRNA、D-D水平明顯升高，升高水平與心力衰竭程度、LVEF有關(guān)，且在心力衰竭程度判斷中具有重要意義，可為臨床治療方案及病情評估提供依據(jù)。