張春玉，姜福佳，劉 東，李 季，于麗靜，耿 敏

(1.長春職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物學(xué)院，吉林 長春 130033；2.吉林工商學(xué)院糧食學(xué)院，吉林 長春 130507)

隨著工業(yè)的快速發(fā)展，大量有機化合物和工業(yè)“三廢”等有毒、有害污染物排放到環(huán)境中，特別隨著動物避孕藥等畜牧業(yè)用藥在飼料中使用頻率的增加，含有過量雌激素的動物糞便和尿液不斷排放到土壤和水體.由于雌激素具有生物蓄積時間長、自然條件下難降解的特點，因此雌激素污染問題隨之而來，雌激素污染帶來的食品安全問題也逐步引起人們的關(guān)注[1-3].雌激素屬于內(nèi)分泌干擾物，不易被降解，它能嚴(yán)重干擾人類正常內(nèi)分泌物質(zhì)的形成及代謝等過程，危害人類健康[4-6].大量雌激素污染物通過吸附—解吸、遷移、轉(zhuǎn)化等途徑在土壤和水體中富集[7-9]，再經(jīng)過動、植物食物鏈進(jìn)行人體，已經(jīng)成為威脅人類健康的重大問題[10].雌二醇(Estradiol，E2)是活性最高、干擾作用最大的環(huán)境雌激素[3]；而乙炔雌二醇(Ethinylestradiol，EE2)是一種人工合成的雌激素，其在雌激素類污染物中具有十倍的毒性效力[11].研究[12]表明，雌激素進(jìn)入環(huán)境后并不會產(chǎn)生明顯的生物效應(yīng)，未見有植物根部出現(xiàn)中毒、植株枯萎死亡和產(chǎn)量降低等的研究報道；然而雌激素可由被污染的土壤中進(jìn)入植物體內(nèi)并進(jìn)行富集[13-14]，人類可能通過食用這些受污染的植物而受到危害，造成嚴(yán)重的食品安全問題.

為了證實雌激素對農(nóng)作物，特別是對重要的糧食作物和油料作物——大豆是否存在生長抑制或體內(nèi)富集等潛在危害，本文以E2和EE2為主要研究對象，通過水培大豆實驗，研究了雌激素對大豆萌發(fā)過程中下胚軸生長的影響，并分析了大豆的根、莖葉、果實對E2和EE2的吸收、富集特點.

1 材料與方法

1.1 化學(xué)試劑

E2和EE2購自Sigma-aldrich(西格瑪奧德里奇，上海)貿(mào)易有限公司；提取溶劑使用分析純氯仿(北京化工)；色譜純乙腈購于Themo Fisher Scientific(賽默飛巴爾科技)公司；超純水(Ultrapure water，18.2 MΩcm-1) ，用于高效液相色譜(HPLC)分析.

1.2 實驗儀器

電子天平(杭州萬特衡器有限公司)，離心機(Avanti JXN-26，BECKMAN COULTER和Centrifuge 5430 R，Eppendorf)，真空干燥機BZF-30，高效液相色譜(HPLC)儀(Waters e2695)，檢測器為UV(2988 Waters Detector)，色譜柱為C18柱(粒徑5 μm，4.6 mm×150 mm)，氣相色譜-聯(lián)用質(zhì)譜儀(Agilent 7890A/5975C).

1.3 大豆處理實驗

1.3.1 豆芽的培養(yǎng)與雌激素處理

取適量健康的大豆(和平1號)置于潔凈托盤中，加入少量雙蒸水，用紗布覆蓋保持潮濕，在25℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)3 d，期間每天更換3次水.待大豆發(fā)出芽體，選取大小一致的豆芽30株，用浮漂將豆芽固定，向豆芽根部加入雙蒸水并沒過根部，避免將豆芽全部浸泡.隨機將30株大豆芽分為5組，即E2濃度分別為0(對照組)及0.002，0.01，0.02，0.05 mmol/L處理組，每組6株豆芽.上述豆芽室溫條件下連續(xù)處理5 d.

1.3.2 大豆植株的雌激素處理

于6月下旬，從大田中選取整株長勢一致、剛剛長出細(xì)小豆莢的大豆植株(和平1號)，根部用水洗滌并將大豆植株移栽于水培箱中，用Hoagland 營養(yǎng)液緩苗培養(yǎng)3 d.選擇生長一致的大豆植株24株，隨機分為6組，分別是對照組(不添加E2和EE2)；E2組(E2濃度分別為0.002，0.01，0.02，0.05 mmol/L)；EE2組(EE2濃度為0.05 mmol/L)，每組大豆植株4株.每天更換處理液，定時補充蒸發(fā)的水分，處理期間注意避雨.連續(xù)處理10 d后收取大豆材料進(jìn)行實驗.

1.4 大豆樣品雌激素提取

制備豆芽樣品[15]：從處理液中取出萌發(fā)5 d的豆芽，用雙蒸水進(jìn)行充分清洗，測量豆芽長度并提取雌激素.雌激素提取方法為：用研磨器將整棵豆芽充分研磨混勻，稱取1 g樣品放入10 mL 離心管中，加入1 mL ddH2O混勻；再加入1 mL氯仿，搖床振搖20 min，4 000 r/min離心10 min；吸取下相(氯仿相)500 μL，13 000 r/min離心10 min；再取下相300 μL進(jìn)行真空干燥，4℃冰箱保存、待測.

制備大豆植株樣品：將整棵大豆植株用雙蒸水充分清洗，去除表面雜質(zhì)后，用濾紙干燥.分別剪取豆莢、莖葉和根部，進(jìn)行雌激素提取，方法同上.

1.5 雌激素HPLC檢測

利用HPLC(Waters e2695) 檢測雌激素.檢測器為UV(2988 Waters Detector).色譜柱為C18柱(粒徑5 μm，4.6 mm×150 mm，Waters).液相色譜分離條件為：以V(乙腈)∶V(水)= 50 ∶ 50作為流動相，流速為1.0 mL/min，λ=225 nm，進(jìn)樣量為5 μL，柱溫為27℃.每個實驗、對照均重復(fù)4次.

2 結(jié)果與分析

2.1 E2和EE2的HPLC檢測

利用高效液相色譜儀對0.1 mmol/L E2和 EE2的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行分析和檢測，HPLC檢測結(jié)果見圖1.由圖1可見，E2和EE2分別在4.1 min和5.1 min出現(xiàn)了兩個色譜峰，峰型尖銳對稱、無拖尾現(xiàn)象，說明建立了E2和 EE2的良好檢測條件.

圖1 0.1 mmol/L E2和EE2標(biāo)準(zhǔn)品HPLC譜圖

2.2 E2對豆芽下胚軸生長的影響

不同濃度E2處理下，培養(yǎng)5 d后豆芽的生長變化情況如圖2a所示.對照組經(jīng)過5 d的培養(yǎng)，豆芽下胚軸的長度由最初的平均3.5 cm伸長到17.8 cm，并生長出10余根根毛，根毛較長；E2處理下，大豆下胚軸的伸長生長受到了不同程度的抑制，同時根毛的數(shù)量也發(fā)生了顯著的變化.

0.002 mmol/L E2處理下，豆芽下胚軸的伸長生長受到了輕微的抑制，與對照相比，下胚軸長度降低了9.0%；根毛的數(shù)量也有所減少且根毛的長度縮短.0.01 mmol/L和0.02 mmol/L E2的處理下，豆芽下胚軸的伸長生長進(jìn)一步受到抑制，平均長度為14.1 mm和12.6 mm，與對照相比，下胚軸長度降低了20.8%和29.2%；根部的根毛僅長出1～4根，長度極短.隨著E2濃度的進(jìn)一步增加，0.05 mmol/L E2處理下，豆芽下胚軸的伸長受到嚴(yán)重抑制，長度僅為9.8mm，生長速度下降了 44.9%；根部未見根毛生成.E2處理濃度的升高不僅加劇了對豆芽下胚軸伸長生長的抑制，而且對根毛的產(chǎn)生和伸長長度也出現(xiàn)了顯著的抑制(見圖2b).

a不同濃度E2處理下豆芽下胚軸的變化；b不同濃度E2處理對豆芽下胚軸伸長生長的影響

2.3 大豆芽中E2含量分析

利用HPLC檢測大豆芽在不同濃度E2處理下E2含量變化的情況，結(jié)果見圖3.由圖3可見，低濃度E2(0.002 mmol/L)處理下，大豆幼苗中在4.1 min處沒有吸收峰出現(xiàn)；當(dāng)E2濃度≥0.01 mmol/L時，隨著E2濃度的升高，大豆芽對E2的富集隨之增加，說明高濃度的E2會造成豆芽體內(nèi)E2的富集，這可能也是造成大豆芽下胚軸伸長生長受阻的主要原因.

圖3 不同濃度E2處理下大豆幼苗中E2含量的HPLC

2.4 大豆根系中E2含量分析

不同E2處理下大豆根部E2含量的HPLC檢測結(jié)果見圖4.由圖4可見，不同濃度E2處理的大豆根部在4.1 min均出現(xiàn)肩峰，肩峰數(shù)值較低.根據(jù)植物根系對有機物吸收的特點，推測這種現(xiàn)象可能是由于根部對E2僅僅是吸附作用而不是富集作用.

圖4 不同濃度E2處理下大豆根系中E2含量的HPLC

2.5 大豆果實中E2含量分析

對不同濃度E2處理液中生長的大豆果實進(jìn)行HPLC檢測，結(jié)果見圖5.由圖5可見，在不同濃度E2的培養(yǎng)環(huán)境中，所有參與檢測的大豆果實中均可檢測到E2，而且果實中E2的含量隨著處理液中E2濃度的升高而增加.這一結(jié)果說明E2能夠在大豆果實中進(jìn)行富集，并隨著環(huán)境中E2濃度的升高，富集程度呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系.這一現(xiàn)象的出現(xiàn)可能是由于大豆果實中油脂含量較高，而雌激素為脂溶性物質(zhì)，因此能夠在大豆果實中富集.

圖5 不同濃度E2處理下大豆果實中E2含量的HPLC

2.6 大豆莖葉中E2含量分析

大豆莖葉中E2含量的HPLC檢測結(jié)果見圖6.由圖6可見，莖葉樣品在4.1 min處未發(fā)現(xiàn)E2的吸收峰，說明E2不能在大豆的莖葉中富集.

圖6 不同濃度E2處理下大豆莖葉中E2含量的HPLC

2.7 大豆根部EE2含量分析

大豆根部EE2富集情況的HPLC檢測結(jié)果見圖7.由圖7可見，濃度為0.05 mmol/L的EE2處理10 d后，與對照組相比，大豆根部在5.1 min處出現(xiàn)一個小吸收峰，表明EE2在大豆根部有一定程度的積累.

圖7 不同濃度EE2處理下大豆根系中EE2含量的HPLC

2.8 大豆果實中EE2含量分析

大豆果實中EE2富集情況的HPLC檢測結(jié)果見圖8.由圖8可見，經(jīng)過0.05 mmol/L濃度的EE2培養(yǎng)后，相對于對照組大豆果實在5.1 min處出現(xiàn)一個吸收峰，說明在該濃度條件下，EE2可在大豆果實中富集.

圖8 不同濃度EE2處理下大豆果實中EE2含量的HPLC

2.9 EE2在大豆莖葉中的富集情況

大豆莖葉中EE2富集情況的HPLC檢測結(jié)果見圖9.由圖9可見，經(jīng)過濃度為0.05 mmol/L的EE2培養(yǎng)，與對照組相比，處理組的大豆莖葉在5.1 min處并沒有吸收峰出現(xiàn)，表明EE2在大豆莖葉中不能富集.

圖9 不同濃度EE2處理下大豆莖葉中EE2含量的HPLC

3 討論

3.1 E2對大豆萌發(fā)具有抑制作用

本文的研究結(jié)果表明，大豆在萌發(fā)過程中隨著E2處理濃度由0.002 mmol/L逐步升高到0.05 mmol/L，對大豆生長的抑制作用呈現(xiàn)逐漸增強的趨勢.無論是低濃度的E2還是高濃度的E2均對大豆下胚軸的伸長生長起到了抑制作用，且隨著E2處理濃度的升高，下胚軸生長受到的抑制作用越強；同時根毛的數(shù)量和長度也隨E2處理濃度的升高而減少，0.05 mmol/L E2處理時，沒有根毛生長.HPLC分析結(jié)果表明，大豆芽對E2的富集隨著處理液濃度的升高而增加，E2在大豆芽的富集是抑制大豆萌發(fā)過程中下胚軸延伸和根毛生成的主要原因.

3.2 雌激素在大豆體內(nèi)的富集特點

本文的研究結(jié)果表明，E2和EE2在大豆植株各部分的富集作用存在差異.大豆根系僅在高濃度(0.05 mmol/L)雌激素作用下才能檢測出來，且含量較低，說明根系對雌激素具有吸附和吸收的特點，并不在根系中富集.對于大豆果實而言，無論是E2還是EE2在果實中的含量均隨外界雌激素的增加而增加，說明果實是雌激素積累的主要部位.在各濃度E2和EE2對大豆莖葉的處理下，通過HPLC法在莖葉中均未檢測出雌激素的存在，表明E2和EE2不能在大豆的莖葉中富集，莖葉只是起到了運輸?shù)淖饔?由于大豆的可食用部分主要是果實，因此果實中E2和EE2的富集現(xiàn)象表明，環(huán)境中的雌激素會產(chǎn)生食品安全風(fēng)險，從而對人類健康造成危害.

4 結(jié)論

通過本文研究可以證實：E2對大豆下胚軸的延伸和根系形成具有抑制作用，且抑制作用隨E2處理濃度的升高而增強.E2和EE2在大豆根、莖葉和果實的富集特點不同，主要富集在大豆果實中，這說明環(huán)境中的雌激素可以通過大豆進(jìn)入食物鏈，從而對人體健康造成潛在的威脅，環(huán)境中雌激素的危害應(yīng)該受到廣泛的關(guān)注.