祁琴 王曉梅 吳煥淦 包春輝 馬曉芃 趙琛 朱毅 劉慧榮 施茵 黃艷 劉雅楠

摘要 目的：觀察針灸對克羅恩?。–D）大鼠結(jié)腸組織DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的影響，初步探討針灸對CD的表觀遺傳調(diào)控機制。方法：將SD大鼠隨機分為空白組、模型組、隔藥餅灸組、電針組和柳氮磺吡啶組。采用5% 2，4，6-三硝基苯磺酸灌腸的方法制備CD大鼠模型。隔藥餅灸組和電針組均采用天樞（雙側(cè)）和氣海穴進行干預，柳氮磺吡啶組采用柳氮磺吡啶腸溶片進行灌胃干預。治療結(jié)束后，采用ELISA檢測血清中C反應蛋白（CRP）、IL-6、白細胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的含量;實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測結(jié)腸組織中缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）的mRNA表達;Western Blotting檢測結(jié)腸組織中DNMT1、DNMT3a、DNMT3b蛋白的表達。結(jié)果：與正常組比較，模型組血清中CRP、IL-6、IL-1β、TNF-α的蛋白含量均顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，隔藥餅灸組、電針組和柳氮磺吡啶組上述炎癥介質(zhì)的蛋白含量均顯著降低（P<0.01）。與正常組比較，模型組結(jié)腸組織中HIF-1α mRNA和DNMT1、DNMT3a、DNMT3b蛋白表達均顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，隔藥餅灸組和柳氮磺吡啶組HIF-1α mRNA和DNMT1、DNMT3a、DNMT3b蛋白表達均顯著降低（P<0.05或P<0.01），電針組HIF-1α mRNA和DNMT1蛋白表達均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：隔藥餅灸和電針均能抑制CD大鼠CRP、IL-6、IL-1β、TNF-α等炎癥介質(zhì)以及HIF-1α、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT1的表達，其中隔藥餅灸還能抑制DNMT3a、DNMT3b表達，可能是針灸減輕CD腸道炎癥的機制之一。

關鍵詞 克羅恩病;針灸;DNA甲基轉(zhuǎn)移酶;表觀調(diào)控;缺氧誘導因子

Effects of Acupuncture and Moxibustion on Colonic DNA Methyltransferase Under Hypoxic Environment in Rats with Crohn′s Disease

QI Qin1，WANG Xiaomei1，WU Huangan1，2，BAO Chunhui1，MA Xiaopeng1，2，ZHAO Chen3，ZHU Yi1，LIU Huirong1，2，SHI Yin1，HUANG Yan1，LIU Yanan1

（1 Shanghai Research Institute of Acupuncture and Meridian，Shanghai 200030，China; 2 Yueyang Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200437，China; 3 School of Acupuncture-Moxibustion and Tuina，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 201203，China）

Abstract Objective：To observe the effects of acupuncture and moxibustion on DNA methyltransferase in the colon tissues of rats with Crohn′s disease （CD） and explore the mechanism of acupuncture and moxibustion in the epigenetic regulation of CD.Methods：SD rats were randomly divided into a normal group，a model group，an indirect moxibustion group，an electroacupuncture （EA） group，and a sulfasalazine group.The CD model was induced by enema with 5% 2，4，6-trinitrobenzene sulfonic acid in rats.The rats in the indirect moxibustion group and the EA group were treated correspondingly at bilateral “Tianshu” （ST 25） and “Qihai” （CV 6），and those in the sulfasalazine group received sulfasalazine enteric-coated tablets by gavage.ELISA was used to detect the protein content of CRP，IL-6，IL-1β，and TNF-α in the serum.RT-qPCR was used to detect the expression of HIF-1α mRNA in the colon tissues.Western Blotting was used to detect the protein expression of DNMT1，DNMT3a，and DNMT3b in the colon tissues.Results：Compared with the normal group，the model group showed increased protein content of CRP，IL-6，IL-1β，and TNF-α in the serum （P<0.01）.Compared with the model group，the indirect moxibustion group，the EA group，and the sulfasalazine group showed decreased protein content of the above-mentioned inflammatory factors （P<0.01）.Compared with the normal group，the model group displayed increased expression of HIF-1α mRNA and DNMT1，DNMT3a，and DNMT3b proteins in the colon tissues （P<0.01）.Compared with the model group，the indirect moxibustion group and the sulfasalazine group exhibited decreased expression of HIF-1α mRNA and DNMT1，DNMT3a，and DNMT3b proteins （P<0.05 or P<0.01），and the EA group showed reduced expression of HIF-1α mRNA and DNMT1 protein （P<0.05 or P<0.01）.Conclusion：The indirect moxibustion and EA can both inhibit the expression of inflammatory factors such as CRP，IL-6，IL-1β，TNF-α，as well as HIF-1α and DNMT1 in CD rats，and the indirect moxibustion can also inhibit the expression of DNMT3a and DNMT3b，which may be one of the mechanisms of acupuncture and moxibustion in reducing intestinal inflammation in CD.

Keywords Crohn′s disease; Acupuncture and moxibustion; DNA methyltransferase; Epigenetic regulation; Hypoxia-inducible factor

中圖分類號：R245文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.03.005

克羅恩?。–rohn′s Disease，CD）屬于炎癥性腸?。↖nflammatory Bowel Disease，IBD）的一種，常表現(xiàn)為消化道管壁全層性炎癥，可并發(fā)腸狹窄、腸梗阻，多數(shù)患者終生反復發(fā)作。近年來，國內(nèi)發(fā)病率逐年升高，至今仍缺乏理想的治療方法，是一種難治性腸腑病癥。研究表明，CD主要由遺傳易感性、環(huán)境因素、腸道菌群紊亂等交互作用，引發(fā)機體先天免疫和獲得性免疫失調(diào)而發(fā)病，但其具體發(fā)病機制尚未完全闡明[1]。

表觀遺傳機制在遺傳易感性與環(huán)境之間的作用，既可引發(fā)CD，又可維持腸道黏膜炎癥。DNA甲基化是表觀遺傳調(diào)控的重要組成部分，是造成基因沉默的重要因素之一[2]。晚近，發(fā)現(xiàn)DNA甲基化在CD炎癥中的關鍵作用[3]，CD患者外周血、結(jié)腸黏膜等全基因組DNA甲基化圖譜不同于健康對照組，患者免疫功能與相關基因的DNA甲基化密切相關[4]。DNA甲基化模式由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA Methyltransferase，DNMT）負責建立和維持，在哺乳動物中參與DNA甲基化的DNMTs主要包括DNMT1、DNMT3a和DNMT3b[5-7]。本研究通過觀察針灸對CD大鼠低氧環(huán)境下結(jié)腸組織3種發(fā)揮DNA甲基化催化作用的甲基轉(zhuǎn)移酶表達的影響，初步探討針灸對CD的表觀遺傳調(diào)控機制，以期為針灸治療CD的臨床應用提供實驗資料和科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康清潔級雄性SD（Sprague-Dawley）大鼠，體質(zhì)量為（140±20）g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心[實驗動物許可證號：SCXK（滬）2020-0009]。所有實驗過程嚴格遵循上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心倫理委員會的相關規(guī)定，動物福利倫理委員會批準通過（倫理審批號：PZSHUTCM210305005）。

1.1.2 藥物 2，4，6-三硝基苯磺酸（2，4，6-Trinitrobenzene Sulfonic Acid，TNBS）（Sigma，美國，貨號：P2297）;戊巴比妥鈉（Sigma，美國，貨號：P3761）;柳氮磺吡啶腸溶片（上海中西三維藥業(yè)有限公司，國藥準字H31020450）。

1.1.3 試劑與儀器 無水乙醇（國藥集團化學試劑有限公司，貨號：10009228）;電針儀（南京濟生醫(yī)療科技有限公司，貨號：HANS-200A）;CRP ELISA試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，貨號：ml038253-C）;IL-6 ELISA試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，貨號：ml102828-C）;IL-1β ELISA試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，貨號：ml037361-C）;TNF-α ELISA試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，貨號：ml002859-C）;Trizol（TAKARA，日本，貨號：9108-1）;反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TAKARA，日本，貨號：RR420A）;SYBR Master Mixture（TAKARA，日本，貨號：RR037A）;DNMT1抗體（Thermo Fisher Scientific，美國，貨號：MA5-16169）;DNMT3a抗體（CST，美國，貨號：2160S）;DNMT3b抗體（Abcam，英國，貨號：ab227942）;酶標儀（Thermo Fisher Scientific，美國，型號：Multiskan MK3）;電泳槽（BIO-RAD，美國，型號：Mini-PROTEAN Tetra）;電泳儀（BIO-RAD，美國，型號：164-5050）;熒光定量PCR儀（Roche，瑞士，型號：LightCycler 96）;凝膠成像系統(tǒng)（BIO-RAD，美國，型號：Doc XR+1708195）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 大鼠按照隨機數(shù)字表法將大鼠分為空白組、模型組、隔藥餅灸組、電針組、柳氮磺吡啶組，每組8只。參照Morris法[8]，采用2，4，6-三硝基苯磺酸（2，4，6-Trinitrobenzene Sulfonic Acid，TNBS）制備CD大鼠模型，將5%TNBS與50%乙醇按2∶1的比例混合均勻制備灌腸液，根據(jù)大鼠體質(zhì)量給予3 mL/kg灌腸。每周灌腸1次，共4次。

1.2.2 干預方法 空白組和模型組不進行治療。隔藥餅灸組選取天樞（雙側(cè)）、氣海穴進行干預，將制作好的藥餅（以制附子、肉桂等藥研末，用黃酒調(diào)和之后制成厚約0.3 cm，直徑約0.5 cm的藥餅）放置于相應穴位，上置重約90 mg的艾炷，每次每穴各灸2壯。電針組選取天樞（雙側(cè)）、氣海穴進行電針治療。一次性針灸針刺入穴位后，針柄與電針儀的正負極相連，疏密波，頻率2/100 Hz，電流2 mA，留針20 min。柳氮磺吡啶組采用柳氮磺吡啶腸溶片研末制備灌胃溶液，按成人（70 kg體質(zhì)量，4 g/d）與大鼠（200 g體質(zhì)量）1∶0.018比例的劑量進行灌胃。上述治療均1次/d，連續(xù)7 d。標本采集與處理所有干預結(jié)束之后，腹腔注射戊巴比妥鈉（2%，40～50 mg/kg），待大鼠麻醉后，打開腹腔，經(jīng)腹主動脈取血8～10 mL，靜置1 h后離心收集血清，保存于-80 ℃冰箱中用于ELISA的檢測。取肛門向上6～8 cm的結(jié)腸，保存于-80 ℃冰箱中用于實時熒光定量PCR（RT-qPCR）和Western Blotting的檢測。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 ELISA法檢測大鼠血清C反應蛋白（CRP）、白細胞介素-6（IL-6）、IL-1β和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的蛋白含量 設置8個濃度梯度的標準孔;在96孔板中加入標準品或準備好的待測樣品100 μL，37 ℃恒溫孵育30 min;甩去液體，加入洗滌液重復洗板3次;每孔加入50 μL生物素標記的抗體，空白孔除外，37 ℃恒溫孵育30 min;甩去液體，加入洗滌液重復洗板3次;每孔加入100 μL酶標抗體，37 ℃恒溫孵育10 min;甩去液體，加入洗滌液重復洗板3次;每孔加入100 μL底物混合液，37 ℃恒溫避光孵育15 min;每孔加入100 μL終止液，在450 nm波長處測各孔的OD值。

1.2.3.2 RT-qPCR法檢測大鼠結(jié)腸組織缺氧誘導因子-1α（Hypoxia-inducible Factor-1α，HIF-1α） mRNA的表達量 稱取100 mg左右的冷凍結(jié)腸組織，加入1 mL Trizol，提取RNA;將下列反應物依次加入到200 μL Eppendorf管中：4 μL 5×PrimeScript RT Master Mix、x μL（2 μg）總RNA、（16-x）μL RNase free dH2O（總反應物體積為20 μL）逆轉(zhuǎn)錄cDNA;制備總反應體積為25 μL的反應體系：12.5 μL SYBR Green Mix（2×）、1 μL上游引物、1 μL下游引物、cDNA模板2 μL、8.5 μL dH2O，輕柔混勻后進行RT-qPCR擴增反應，條件如下：95 ℃預變性30 s，（95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s）×40個循環(huán)。采用Fold change（2-△△Ct）法進行數(shù)據(jù)分析。引物設計見表1。

1.2.3.3 Western Blotting檢測大鼠結(jié)腸組織中DNMT1、DNMT3a、DNMT3b蛋白的表達 稱取100 mg左右結(jié)腸組織，加入1 000 μL RIPA裂解液、10 μL PMSF蛋白酶抑制劑、20 μL磷酸酶抑制劑后勻漿，離心之后取上清。BCA試劑盒測定大鼠結(jié)腸組織的總蛋白濃度。各孔取30 μg蛋白上樣，在10%聚丙烯酰胺凝膠電泳進行蛋白分離，上層濃縮膠電壓80 V，30 min，下層分離膠120 V;將分離后的蛋白電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜中，電壓為125 V，轉(zhuǎn)膜時間根據(jù)蛋白分子量大小確定;將PVDF膜置于5%脫脂牛奶溶液中室溫封閉1 h，TBST溶液洗膜10 min，重復3次，一抗溶液4 ℃搖床孵育過夜;洗膜10 min，重復3次。二抗溶液搖床上室溫孵育1 h。洗膜10 min，重復3次。按ECL（Ehanced Chemiluminescence）試劑盒說明進行顯影，采用ImageJ圖像分析軟件進行條帶分析，計算灰度值（目的蛋白/內(nèi)參）。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。對服從正態(tài)分布且方差齊的數(shù)據(jù)，組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）中的LSD法;方差不齊性，組間比較采用Games-Howell，結(jié)果均采用均數(shù)±標準差（±s）表示。對不服從正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，組間比較采用非參數(shù)檢驗，采用M（P25，P75）表示。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 針灸對CD大鼠血清CRP、IL-6、IL-1β、TNF-α含量的影響

與空白組比較，模型組CRP、IL-6、IL-1β、TNF-α的含量均顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。隔藥餅灸組、電針組和柳氮磺吡啶組CRP、IL-6、IL-1β、TNF-α的含量顯著低于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。見表2，圖1。

2.2 針灸對CD大鼠結(jié)腸組織HIF-1αmRNA表達的影響

模型組HIF-1α mRNA表達量顯著高于空白組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。隔藥餅灸組、電針組和柳氮磺吡啶組HIF-1α mRNA表達量均顯著低于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義（分別P<0.01，P<0.01，P<0.05）。見表3，圖2。

2.3 針灸對CD大鼠結(jié)腸組織DNMT1、DNMT3a、DNMT3b蛋白表達的影響

與空白組比較，模型組DNMT1、DNMT3a、DNMT3b蛋白的表達顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（分別P<0.01，P<0.01，P<0.05）。與模型組比較，隔藥餅灸組DNMT1、DNMT3a、DNMT3b蛋白的表達顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（均P<0.05）;柳氮磺吡啶組DNMT1、DNMT3a、DNMT3b蛋白的表達也顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（分別P<0.01，P<0.05，P<0.05）。電針組僅DNMT1蛋白的表達顯著低于模型組（P<0.05）。見表4，圖3。

3 討論

甲基轉(zhuǎn)移酶的參與是DNA甲基化發(fā)生過程中的一個關鍵因素，DNMT1在胚胎和成體細胞中均有表達，負責完成復制后新合成鏈的甲基化來維持DNA的甲基化水平，但不能起始甲基化。而DNMT3a和DNMT3b主要在胚胎和胚胎干細胞中具有較高的活性，對早期發(fā)育建立DNA甲基化模式是必不可少的。目前，普遍認為甲基化的維持需要DNMT3a和DNMT3b的參與[9]。已有大量研究表明，DNMTs在結(jié)腸癌、肺癌等多種腫瘤中高表達[10-13]，其機制可能與影響癌基因和抑癌基因的表達有關。DNA甲基化能夠影響細胞因子等相關基因的表達，導致T細胞極化發(fā)生改變，從而導致免疫性疾病的發(fā)生。有研究發(fā)現(xiàn)DNMT1過表達能引起巨噬細胞中CD68的過表達，從而介導促炎反應;DNMT3a可與T細胞受體結(jié)合，通過IL-4和IFN-γ啟動子區(qū)域的甲基化影響T細胞的極化，同時DNMT3a使TNF-α啟動子區(qū)域內(nèi)的CpG島出現(xiàn)高甲基化，在先天性和適應性免疫應答中發(fā)揮重要作用[14]。目前，DNMTs在CD中的作用報道較少，但已有研究發(fā)現(xiàn)DNA甲基化在CD炎癥中的關鍵作用[15]。在CD患者中經(jīng)常觀察到葉酸、維生素B12等甲基供體分子的缺乏、DNA甲基化改變和黏附侵襲性大腸桿菌的高患病率[16-18]。有研究報道CD腸黏膜中α-防御素5、TNF-α表達異常，DNA甲基化狀態(tài)改變，DNA甲基化水平與CD患者外周血CRP的含量呈正相關[19]，是發(fā)生炎癥反應的關鍵環(huán)節(jié)。上述研究均提示DNA甲基化在CD炎癥中發(fā)揮重要作用。

CD炎癥組織由于血管受損和代謝需求增加而長期處于缺氧狀態(tài)，HIF-1α是一種能夠應答低氧環(huán)境，調(diào)控多種基因轉(zhuǎn)錄的核調(diào)節(jié)因子，是腸道在低氧和炎癥環(huán)境下重要的中介因子，有大量研究已證實CD炎癥組織由于血管受損和代謝需求增加而長期處于缺氧狀態(tài)[20]。TNF-α能夠通過增加活性氧的產(chǎn)生激活和增強HIF-1α的DNA活性，從而上調(diào)HIF-1α蛋白的表達，而TNF-α能夠誘導IL-1β和IL-6的產(chǎn)生，同時HIF-1α能給顯著增加TNF-α的產(chǎn)生和分泌，二者相互促進參與眾多疾病的發(fā)生發(fā)展。有研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α在CD結(jié)腸黏膜中表達顯著增加[21]。本研究發(fā)現(xiàn)CD大鼠結(jié)腸組織中HIF-1α mRNA表達顯著高于正常組，與以往研究一致。另外我們還發(fā)現(xiàn)模型組血清中CRP、IL-6、IL-1β和TNF-α的蛋白含量顯著升高，表明CD大鼠體內(nèi)存在較強烈的炎癥反應。在TNBS誘導的CD大鼠模型中，針灸能降低CD大鼠腸黏膜異常增高TNF-α及其受體，抑制腸上皮細胞凋亡，達到減輕腸道炎癥反應的目的[22]。本研究發(fā)現(xiàn)隔藥餅灸組和電針組血清中CRP、IL-6、IL-1β和TNF-α的蛋白含量顯著低于CD模型大鼠，表明隔藥餅灸和電針均能夠顯著抑制CD大鼠體內(nèi)炎癥反應。

課題組前期臨床研究發(fā)現(xiàn)針灸能夠減輕CD大鼠結(jié)腸炎癥，修復受損的腸黏膜[23]，并能糾正輕、中度CD患者結(jié)腸黏膜組織形態(tài)學改變，能夠影響結(jié)腸黏膜組織異常的基因表達譜[24]，但是針灸對CD大鼠DNA甲基化的調(diào)節(jié)作用尚不清楚。本研究通過對CD大鼠低氧狀態(tài)下結(jié)腸組織中3種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶表達的觀察發(fā)現(xiàn)，在CD模型大鼠結(jié)腸組織中DNMT1、DNMT3a和DNMT3b蛋白的表達量均顯著升高，而經(jīng)過隔藥餅灸治療后DNMT1、DNMT3a和DNMT3b蛋白的表達均顯著降低，經(jīng)過電針治療后DNMT1蛋白的表達均顯著降低，DNMT3a和DNMT3b蛋白含量有一定程度降低，但是差異無統(tǒng)計學意義，這可能與隔藥餅灸和電針的作用機制不同有關?？傊狙芯勘砻鞲羲庯灳暮碗娽樉苷{(diào)節(jié)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶表達，而DNA甲基轉(zhuǎn)移酶在DNA甲基化中起催化作用，上述結(jié)果提示CD模型大鼠中可能存在DNA甲基化異常。CD是一種病因復雜的異質(zhì)性疾病，其全基因組甲基化圖譜可為該病的發(fā)病機制提供新思路，DNA甲基化可為CD的診斷、治療提供研究靶點，故在觀察到針灸對DNA甲基轉(zhuǎn)移酶具有調(diào)節(jié)作用的基礎上，未來可以進一步研究針灸對克羅恩病全基因組DNA甲基化圖譜等的影響。另外，目前對CD中DNA甲基化調(diào)控炎癥介質(zhì)和炎性信號通路的相關機制尚不完全清楚，隨著對DNA甲基化調(diào)控在CD研究中的不斷深入，這不僅有利于從基因調(diào)控方面揭示針灸對CD的作用機制，也會為臨床診治提供更加可靠的科學依據(jù)和治療策略。

參考文獻

[1]Packey CD，Sartor RB.Interplay of commensal and pathogenic bacteria，genetic mutations，and immunoregulatory defects in the pathogenesis of inflammatory bowel diseases[J].J Intern Med，2008，263（6）：597-606.

[2]Tirado-Magallanes R，Rebbani K，Lim R，et al.Whole genome DNA methylation：beyond genes silencing[J].Oncotarget，2017，8（3）：5629-5637.

[3]Somineni HK，Venkateswaran S，Kilaru V，et al.Blood-derived DNA methylation signatures of Crohn′s Disease and severity of intestinal inflammation[J].Gastroenterology，2019，156（8）：2254-2265.e3.

[4]Harris RA，Nagy-Szakal D，Pedersen N，et al.Genome-wide peripheral blood leukocyte DNA methylation microarrays identified a single association with inflammatory bowel diseases[J].Inflamm Bowel Dis，2012，18（12）：2334-2341.

[5]Cui D，Xu X.DNA Methyltransferases，DNA Methylation，and Age-Associated Cognitive Function[J].Int J Mol Sci，2018，19（5）：1315.

[6]Chen Z，Zhang Y.Role of Mammalian DNA Methyltransferases in Development[J].Annu Rev Biochem，2020，89：135-158.

[7]Lyko F.The DNA methyltransferase family：a versatile toolkit for epigenetic regulation[J].Nat Rev Genet，2018，19（2）：81-92.

[8]Morris GP，Beck PL，Herridge MS，et al.Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon[J].Gastroenterology，1989，96（3）：795-803.

[9]Jones PA，Liang G.Rethinking how DNA methylation patterns are maintained[J].Nat Rev Genet，2009，10（11）：805-811.

[10]Sanaei M，Kavoosi F.Effect of 5-Aza-2′-Deoxycytidine in Comparison to Valproic Acid and Trichostatin A on Histone Deacetylase 1，DNA Methyltransferase 1，and CIP/KIP Family（p21，p27，and p57） Genes Expression，Cell Growth Inhibition，and Apoptosis Induction in Colon Cancer SW480 Cell Line[J].Adv Biomed Res，2019，8：52.

[11]Lai Q，Xu YH，Chen Q，et al.The loss-of-function of DNA methyltransferase 1 by siRNA impairs the growth of non-small cell lung cancer with alleviated side effects via reactivation of RASSF1A and APC in vitro and vivo[J].Oncotarget，2017，8（35）：59301-59311.

[12]Takano H，Shibata T，Nakamura M，et al.Effect of DNMT3A polymorphisms on CpG island hypermethylation in gastric mucosa[J].BMC Med Genet，2020，21（1）：205.

[13]Abdelfatah E，Kerner Z，Nanda N，et al.Epigenetic therapy in gastrointestinal cancer：the right combination[J].Therap Adv Gastroenterol，2016，9（4）：560-579.

[14]Jones B，Chen J.Inhibition of IFN-gamma transcription by site-specific methylation during T helper cell development[J].EMBO J，2006，25（11）：2443-2452.

[15]Harris RA，Nagy-Szakal D，Pedersen N，et al.Genome-wide peripheral blood leukocyte DNA methylation microarrays identified a single association with inflammatory bowel diseases[J].Inflamm Bowel Dis，2012，18（12）：2334-2341.

[16]Pan Y，Liu Y，Guo H，et al.Associations between Folate and Vitamin B12 Levels and Inflammatory Bowel Disease：A Meta-Analysis[J].Nutrients，2017，9（4）：382.

[17]Klaassen M，Imhann F，Collij V，et al.Anti-inflammatory Gut Microbial Pathways Are Decreased During Crohn′s Disease Exacerbations[J].J Crohns Colitis，2019，13（11）：1439-1449.

[18]Somineni HK，Venkateswaran S，Kilaru V，et al.Blood-Derived DNA Methylation Signatures of Crohn′s Disease and Severity of Intestinal Inflammation[J].Gastroenterology，2019，156（8）：2254-2265.e3.

[19]Cerrillo E，Moret I，Iborra M，et al.Alpha-defensins（α-Defs） in Crohn′s disease：decrease of ileal α-Def 5 via permanent methylation and increase in plasma α-Def 1-3 concentrations offering biomarker utility[J].Clin Exp Immunol，2018，192（1）：120-128.

[20]Van Welden S，Selfridge AC，Hindryckx P.Intestinal hypoxia and hypoxia-induced signalling as therapeutic targets for IBD[J].Nat Rev Gastroenterol Hepatol，2017，14（10）：596-611.

[21]許春梅，董衛(wèi)國，余保平，等.低氧誘導因子-1α和炎癥誘導酶在炎癥性腸病中的表達及意義[J].臨床消化病雜志，2005，17（3）：103-105.

[22]Bao CH，Wu LY，Wu HG，et al.Moxibustion inhibits apoptosis and tumor necrosis factor-alpha/tumor necrosis factor receptor 1 in the colonic epithelium of Crohn′s disease model rats[J].Dig Dis Sci，2012，57（9）：2286-2295.

[23]祁琴，吳璐一，吳煥淦，等.艾灸對克羅恩病大鼠腸道神經(jīng)元及神經(jīng)肽蛋白表達的影響（英文）[J].World Journal of Acupuncture-Moxibustion，2017，27（3）：40-48，62.

[24]翁志軍，汪迪，鄭寒丹，等.針灸對克羅恩病患者結(jié)腸黏膜基因表達譜的影響[J].上海針灸雜志，2021，40（3）：269-278.

（2022-01-06收稿 本文編輯：吳珊）