祁明浩，吳 堅(jiān)，張 一，陳玉超

(南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029)

胃癌是嚴(yán)重威脅人類生命健康的重大疑難疾病，在我國(guó)胃癌的發(fā)病率位于全部惡性腫瘤的第2位，病死率位于全部惡性腫瘤的第3位[1]。我國(guó)尚沒有開展胃癌的篩查工作，胃癌經(jīng)常到晚期才得到診斷，而晚期胃癌患者的中位生存期僅為7～10個(gè)月[2]。手術(shù)是治療胃癌最為有效也是目前為止唯一有可能治愈的手段，而晚期胃癌無法實(shí)施根治手術(shù)，多采用化療、分子靶向治療、對(duì)癥支持、中醫(yī)中藥等姑息療法。江蘇省中醫(yī)院2009年成為首批國(guó)家中醫(yī)臨床研究基地，在國(guó)內(nèi)牽頭開展了胃癌中醫(yī)藥治療的循證醫(yī)學(xué)研究。在晚期胃癌研究領(lǐng)域，由首屆全國(guó)名中醫(yī)劉沈林教授領(lǐng)銜，開展了“中醫(yī)藥對(duì)晚期胃癌生存期影響的干預(yù)方案及推廣應(yīng)用”(國(guó)家中醫(yī)藥行業(yè)科研專項(xiàng)，編號(hào)：201007007)，前期基于全國(guó)5個(gè)研究中心232例的隊(duì)列研究結(jié)果表明：晚期胃癌患者在化療的基礎(chǔ)上服用健脾養(yǎng)正消癥方可以延長(zhǎng)生存期，同時(shí)改善生活質(zhì)量[3]，但健脾養(yǎng)正消癥方治療胃癌的作用機(jī)制有待明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是近年來新興的研究領(lǐng)域，為中藥復(fù)方多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的特點(diǎn)提供了新的研究模式。筆者擬從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的角度探討健脾養(yǎng)正消癥方治療胃癌的主要有效成分和作用靶點(diǎn)，為進(jìn)一步深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1健脾養(yǎng)正消癥方有效成分和靶點(diǎn)的獲取 應(yīng)用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)。在“Herb name”中，分別檢索健脾養(yǎng)正消癥方中的每味中藥：黨參、白術(shù)、茯苓、山藥、薏苡仁、陳皮、木香、當(dāng)歸、白芍、菝葜、石見穿、甘草，并設(shè)置篩選條件為：生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18、半衰期(HL)≥4 h，從而獲得這些中藥的有效成分，合并去重。在“Related Targets”中(主要源自DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù))獲得上述有效成分的靶點(diǎn)。在Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org/)中查詢上述靶點(diǎn)，獲得對(duì)應(yīng)的“Gene Name”。

1.2胃癌疾病靶點(diǎn)的獲取 應(yīng)用GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/)，在“disorders”中檢索“gastric cancer”，獲得相關(guān)靶點(diǎn)。在OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)(https://omim.org/)中檢索“gastric cancer”，獲得相關(guān)靶點(diǎn)。將這兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的所有靶點(diǎn)合并去重。

1.3健脾養(yǎng)正消癥方和胃癌的共同靶點(diǎn)獲取 使用R3.6.3軟件獲得兩者靶點(diǎn)的交集，并繪制維恩圖。

1.4構(gòu)建健脾養(yǎng)正消癥方有效成分-靶點(diǎn)調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 使用Cytoscape3.8.0軟件，根據(jù)健脾養(yǎng)正消癥方有效成分和胃癌的共同靶點(diǎn)繪制中藥調(diào)控網(wǎng)絡(luò)示意圖。

1.5構(gòu)建健脾養(yǎng)正消癥方蛋白互作網(wǎng)絡(luò) 在String數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/)中導(dǎo)入獲得的共同靶點(diǎn)，繪制蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系(PPI)網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)返回的結(jié)果，獲得核心蛋白。

1.6GO功能富集和KEGG通路富集分析 使用R3.6.3軟件，將Gene Name轉(zhuǎn)換為Gene ID；進(jìn)行GO(Gene Ontology，基因本體)功能富集分析，繪制柱狀圖；進(jìn)行KEGG( Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，京都基因和基因組百科全書)通路富集分析，繪制氣泡圖。

2 結(jié) 果

2.1健脾養(yǎng)正消癥方的有效成分和靶點(diǎn) 健脾養(yǎng)正消癥方12味中藥的有效成分，合并去重共152個(gè)。“有效成分-靶點(diǎn)”信息共1 917條，涉及靶點(diǎn)共276個(gè)。

2.2胃癌疾病靶點(diǎn) 在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到胃癌相關(guān)靶點(diǎn)1 825個(gè)，在OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到胃癌相關(guān)靶點(diǎn)170個(gè)，兩者合并去重后共1 904個(gè)。

2.3健脾養(yǎng)正消癥方和胃癌疾病的共同靶點(diǎn) 兩者共同靶點(diǎn)共135個(gè)(見圖1)。

圖1 健脾養(yǎng)正消癥方和胃癌的共同靶點(diǎn)維恩圖

2.4健脾養(yǎng)正消癥方有效成分-靶點(diǎn)調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 如圖2所示，藍(lán)色的節(jié)點(diǎn)表示118個(gè)有效成分，綠色的節(jié)點(diǎn)表示135個(gè)靶點(diǎn)，紫色的邊1 370條表示節(jié)點(diǎn)間的相關(guān)作用關(guān)系。根據(jù)有效成分的自由度大小，主要有效成分有槲皮素(quercetin)、山柰酚(kaempferol)、β-谷固醇(beta-sitosterol)、木犀草素(luteolin)、豆甾醇(Stigmasterol)、柚皮素(naringenin)等，見圖3。

圖2 健脾養(yǎng)正消癥方治療胃癌的有效成分-靶點(diǎn)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

圖3 健脾養(yǎng)正消癥方治療胃癌的主要有效成分

2.5健脾養(yǎng)正消癥方的蛋白互作網(wǎng)絡(luò) 如圖4所示，每個(gè)圓圈(節(jié)點(diǎn))代表一個(gè)蛋白質(zhì)，節(jié)點(diǎn)內(nèi)的圖案代表該蛋白的三維結(jié)構(gòu)，節(jié)點(diǎn)間的連線代表蛋白間的相互作用關(guān)系，連線的顏色代表相關(guān)作用類型，連線的粗細(xì)代表相互作用強(qiáng)度。其中，核心調(diào)控蛋白有：AKT1、IL6、CASP3、VEGFA、MAPK3、MYC、EGFR、JUN、MAPK1、CCND1等，見圖5。

圖4 健脾養(yǎng)正消癥方治療胃癌的蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系(PPI)網(wǎng)絡(luò)

圖5 健脾養(yǎng)正消癥方的核心調(diào)控蛋白

2.6GO功能富集和KEGG通路富集分析 如圖6所示，GO功能富集主要有：泛素樣蛋白連接酶結(jié)合(ubiquitin-like protein ligase binding)、激酶調(diào)節(jié)劑活性(kinase regulator activity)、磷酸酶結(jié)合(phosphatase binding)、泛素蛋白連接酶結(jié)合(ubiquitin protein ligase binding)、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活劑活性/RNA聚合酶Ⅱ特異性(DNA-binding transcription activator activity, RNA polymerase Ⅱ-specific)等。如圖7所示，KEGG通路和本研究相關(guān)的富集主要有：PI3K-Akt信號(hào)通路(PI3K-Akt signaling pathway)、細(xì)胞衰老(Cellular senescence)、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥(EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance)、鉑類藥物耐藥(Platinum drug resistance)等。

圖6 健脾養(yǎng)正消癥方治療胃癌的GO功能富集分析

圖7 健脾養(yǎng)正消癥方治療胃癌的KEGG通路富集分析

3 討 論

健脾養(yǎng)正消癥方是首屆全國(guó)名中醫(yī)、著名中醫(yī)消化腫瘤專家劉沈林教授所創(chuàng)制，由古方資生丸化裁而成。劉教授指出，晚期胃癌的病機(jī)關(guān)鍵乃脾虛正衰、癌毒彌留。治療上一是健脾養(yǎng)正，以滋養(yǎng)后天；一是化瘀消癥，以攻毒散結(jié)。方中黨參、炒白術(shù)、茯苓、淮山藥、生薏苡仁益氣健脾滲濕；陳皮、木香理氣和胃；當(dāng)歸、白芍養(yǎng)血和營(yíng)；菝葜、石見穿解毒抗癌；炙甘草調(diào)和諸藥。

該方藥治療胃癌共有118個(gè)有效成分，其主要成分有槲皮素、山柰酚、β-谷固醇、木犀草素、豆甾醇、柚皮素、薯蕷皂苷元、7-甲氧基-2-甲基異黃酮、川陳皮素、甘草查爾酮A等。槲皮素存在于甘草、石見穿中，通過阻斷胃癌干細(xì)胞中的磷酸肌醇3激酶(PI3K)-Akt信號(hào)傳導(dǎo)來觸發(fā)線粒體凋亡依賴性生長(zhǎng)抑制[4]；增強(qiáng)胃癌化療藥物伊立替康及其代謝產(chǎn)物 SN-38在人AGS細(xì)胞系中的功效[5]；通過調(diào)節(jié)Akt-mTOR信號(hào)和缺氧誘導(dǎo)的因子1α(HIF-1α)信號(hào)來激活自噬[6]。山柰酚存在于白芍、甘草中，通過IRE1-JNK-CHOP途徑誘導(dǎo)自噬性細(xì)胞死亡并抑制胃癌細(xì)胞中的G9a[7]。β-谷固醇存在于當(dāng)歸、白芍、菝葜、石見穿中，在體外可顯著抑制SGC-7901人胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)并誘導(dǎo)其凋亡[8]。木犀草素存在于黨參中，調(diào)節(jié)Notch1、PI3K、AKT、mTOR、ERK、STAT3和P38信號(hào)通路，并調(diào)節(jié)一系列miRNA的表達(dá)，而對(duì)胃癌細(xì)胞產(chǎn)生抗癌作用[9]；木犀草素通過抑制依賴于Notch1表達(dá)的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)分泌來抑制胃癌的血管生成和擬態(tài)血管形成[10]；通過抑制Notch1信號(hào)傳導(dǎo)和逆轉(zhuǎn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)來抑制胃癌進(jìn)展[11]。豆甾醇存在于黨參、山藥、薏苡仁、木香、當(dāng)歸中，能誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，抑制JAK/STAT信號(hào)通路[12]。柚皮素存在于陳皮、甘草中，可抑制SGC-7901細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13]。

健脾養(yǎng)正消癥方治療胃癌的核心調(diào)控蛋白有：AKT1、IL6、CASP3、VEGFA、MAPK3、MYC、EGFR、JUN、MAPK1、CCND1。AKT1編碼一種活性激酶，有助于胃癌的進(jìn)展，促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖[14]。IL6編碼一種細(xì)胞因子，在炎癥和B細(xì)胞成熟中發(fā)揮作用；觸發(fā)STAT3介導(dǎo)的miR-520d-5p抑制及其下游靶點(diǎn)CypB上調(diào)，調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活[15]。CASP3編碼一種蛋白酶，在細(xì)胞凋亡的執(zhí)行階段起著核心作用，CASP家族可能成為胃癌的新預(yù)后指標(biāo)，有助于治療決策[16]。VEGFA編碼一種生長(zhǎng)因子，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，以VEGFA為靶點(diǎn)的藥物貝伐單抗已上市，AVAGAST研究表明：貝伐單抗聯(lián)合化療用于晚期胃癌的一線治療可以改善無進(jìn)展生存期和腫瘤緩解率[17]。

GO功能富集主要有：泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、激酶調(diào)節(jié)劑活性、磷酸酶結(jié)合、泛素蛋白連接酶結(jié)合、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活劑活性/RNA聚合酶Ⅱ特異性等。KEGG通路和本研究相關(guān)的富集主要有：磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶-B(PI3K-Akt)信號(hào)通路、細(xì)胞衰老、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥、鉑類藥物耐藥等。PI3K-Akt信號(hào)通路是最重要的細(xì)胞內(nèi)通路之一，在胃癌等多種癌癥中經(jīng)常被激活，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、細(xì)胞代謝和細(xì)胞骨架重組，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和癌細(xì)胞存活[18]。除了已批準(zhǔn)的依維莫司和替西羅莫司外，許多PI3K-Akt信號(hào)通路的靶向抑制劑正在臨床研發(fā)中，如：斑蝥素通過CCAT1阻斷PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路來抑制胃癌細(xì)胞遷移和侵襲[19]，蓮心堿通過ROS生成和PI3K-Akt途徑抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[20]，碘醚柳胺通過抑制PI3K/Akt/mTOR途徑促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡和自噬[21]。細(xì)胞衰老被認(rèn)為是有效的抗癌機(jī)制，是一種永久的、不可逆的細(xì)胞周期停滯狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞感受到各種壓力時(shí)，包括端?？s短、癌基因激活、腫瘤抑制劑失活和DNA損傷等，就會(huì)觸發(fā)細(xì)胞衰老。如有研究表明[22]，BET抑制劑JQ1通過誘導(dǎo)細(xì)胞衰老來抑制胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲性，BRD4通過E2F/miR-106b-5p/p21軸調(diào)節(jié)胃癌的細(xì)胞衰老。

綜上所述，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法闡明了健脾養(yǎng)正消癥方治療胃癌的主要有效成分為槲皮素、山柰酚、β-谷固醇、木犀草素、豆甾醇等，主要作用靶點(diǎn)為AKT1、IL6、CASP3、VEGFA、MAPK3等，通過PI3K-Akt信號(hào)通路、細(xì)胞衰老等途徑發(fā)揮抗胃癌作用，充分體現(xiàn)了中藥復(fù)方多成分、多靶點(diǎn)、多通路的調(diào)控機(jī)制，盡管網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究還存在一定的局限性[23]，但為健脾養(yǎng)正消癥方治療胃癌的深入研究和開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。