陳慧芳，劉 毅，劉為中

(1 安慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，安徽 安慶 246052；2 合肥醫(yī)工醫(yī)藥有限公司，安徽 合肥 230601)

藥品并非純凈物質(zhì)，在其生產(chǎn)和貯運(yùn)過(guò)程中會(huì)引入和產(chǎn)生雜質(zhì)。其中，具有潛在致癌性的雜質(zhì)更是雜質(zhì)研究和控制的重點(diǎn)[1]。這些具有人體DNA結(jié)構(gòu)直接或間接損傷，繼而產(chǎn)生基因突變或體內(nèi)誘變而具有致癌可能或者傾向的物質(zhì)為基因毒性雜質(zhì)(Genotoxic Impurity，GTI)。目前，許多法規(guī)機(jī)構(gòu)如ICH、FDA等都對(duì)GTI有了明確的要求，其中ICH也針對(duì)基因毒性雜質(zhì)制定了M7指導(dǎo)原則[2-5]。

缺血性心肌病是心肌處于長(zhǎng)期缺血致使心肌組織彌漫性纖維化的臨床綜合征，心衰是缺血性心肌病發(fā)展到一定階段的必然表現(xiàn)，會(huì)導(dǎo)致心功能迅速下降[6-7]。磷酸肌酸是人體內(nèi)自由的活性物質(zhì)，專為ATP補(bǔ)充能量。磷酸肌酸鈉是其藥用形式，可作為治理缺血性心肌損害、室性心律失常以及改善心衰的重要輔助藥物。但是在合成磷酸肌酸鈉原料藥的過(guò)程中，可能涉及潛在GTI的遺傳毒性雜質(zhì)。朱永琴等研究人員對(duì)其中磷酸三乙酯、肌酸磷酸二乙酯、肌酐磷酸二乙酯檢測(cè)進(jìn)行了報(bào)道[8]，島津儀器公司對(duì)肌酸磷酸二甲酯、肌酸酐磷酸二甲酯、肌酸磷酸二乙酯、肌酸酐磷酰二乙酯檢測(cè)進(jìn)行了報(bào)道，但是對(duì)磷酸甲酯均未見(jiàn)報(bào)到。本文才用超高效液相色譜-串三重四級(jí)桿質(zhì)譜法，建立了磷酸肌酸鈉中磷酸甲酯的含量測(cè)定方法，為磷酸肌酸鈉的質(zhì)量控制提供了參考依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

甲醇(色譜純)，霍尼韋爾公司；磷酸甲酯(對(duì)照品，批號(hào)：AL170628-19)，斯坦?；瘜W(xué)公司；磷酸肌酸鈉(批號(hào)：191001),合肥醫(yī)工醫(yī)藥；實(shí)驗(yàn)用水為自制超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-30A超高效液相色譜儀；三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀LCMS-8050連用系統(tǒng)，島津儀器公司；電子天平，賽多利斯儀器公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 對(duì)照品溶液制備

取磷酸甲酯對(duì)照品適量，精密稱定，置50 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 mL置于100 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液濃度為 30 μg/L。

2.1.2 供試品溶液制備

取磷酸磷酸肌酸鈉適量，精密稱定，置20 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 mL置于10 mL量瓶中，加水溶解并定量稀釋制成每1 L約含磷酸肌酸鈉50 mg的溶液，搖勻，即得。

2.1.3 色譜條件

Shim-pack Gist C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，2 μm)；流動(dòng)相(水-甲醇)；流速(0.35 mL/min)；柱溫(40 ℃)；進(jìn)樣體積2 μL。

表1 梯度時(shí)間程序Table 1 Gradient time series

2.1.4 質(zhì)譜條件優(yōu)化

LCMS-8050接電噴霧離子源，采用正離子化模式；霧化器流量：3.0 L/min；接口電壓：4.5 kV；加熱器流量：10.0 L/min；接口溫度：300 ℃；DL溫度：250 ℃；加熱塊溫度：400 ℃；干燥器流量：10.0 L/min；駐留時(shí)間：10ms。采用ESI+模式進(jìn)行全掃描確定磷酸甲酯母離子，通過(guò)PIS掃描確定定量離子，并對(duì)該離子碰撞能量進(jìn)行優(yōu)化。采用動(dòng)態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)分析磷酸甲酯，得到質(zhì)譜參數(shù)如下：監(jiān)測(cè)離子對(duì)(141.10>79.10)，Q1 Pre(-10.0 V)，CE(-23.0 V)，Q1 Pre(-17.0 V)。磷酸甲酯的MRM色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 磷酸甲酯的MRM色譜圖Fig.1 MRM Chromatogram of methyl phosphate

2.1.5 線性實(shí)驗(yàn)

精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下制備的對(duì)照品溶液0.2 mL、 0.6 mL、1.0 mL、1.4 mL、1.8 mL、2.2 mL分別置于10 mL量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻。按照優(yōu)化后的方法進(jìn)行測(cè)定，以濃度和峰面積進(jìn)行回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，磷酸甲酯的回歸方程為A=75524.05C-3328.17(A為峰面積，C為樣品濃度,μg/L)，在0.6～7.2 μg/L線性范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.9998。

2.1.6 檢測(cè)限測(cè)定

取“2.1.5”項(xiàng)下梯度稀釋的對(duì)照品溶液，按照優(yōu)化后的方法進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得檢測(cè)限濃度為0.16 μg/L。

2.1.7 精密度測(cè)定

取同一對(duì)照品溶液重復(fù)測(cè)定6次，計(jì)算RSD為0.57%，表明儀器精密度良好。

2.1.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

分別取6份磷酸磷酸肌酸鈉10 mg，精密稱定，精密加入對(duì)照品溶液適量，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得平均回收率為97.17%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.94%，表明本法準(zhǔn)確性較好。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 加樣回收率實(shí)驗(yàn)Table 2 sample recovery experiment

2.2 樣品測(cè)定

取供試品溶液分別按照優(yōu)化后的方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算各樣品中磷酸甲酯含量。結(jié)果表明，6批樣品中均未檢出磷酸甲酯。

3 結(jié) 論

磷酸肌酸鈉的合成路線如下：

磷酸肌酸鈉合成反應(yīng)第二步中使用磷酸水解開(kāi)環(huán)，磷酸與溶劑甲醇反應(yīng)生成磷酸甲酯，該化合物屬于致癌警示結(jié)構(gòu)中的磷酸酯類，因此為潛在基因毒性化合物。

本研究建立了超高效液相色譜-串三重四級(jí)桿質(zhì)譜法快速測(cè)定磷酸肌酸鈉中磷酸甲酯含量的方法。利用該方法測(cè)定磷酸甲酯的檢測(cè)限為0.16 μg/L，平均加樣回收率為97.17%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.94%，方法靈敏準(zhǔn)確，為磷酸肌酸鈉質(zhì)量控制提供了可靠的依據(jù)。