魏玉娟，郁梅山，李雪梅，張 苗，王晶晶

(河西學(xué)院，甘肅 張掖 734000)

隨著生活節(jié)奏加快，環(huán)境污染，社會競爭壓力增大以及年齡的增加，都會引起人體內(nèi)產(chǎn)生的酶減少，甚至酶的活性降低。酶數(shù)量和活性的降低都會導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生[1]。微生物酵素食品是以乳酸菌、酵母菌等多菌種復(fù)合發(fā)酵瓜果、蔬菜，形成富含脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶和超氧化物歧化酶及乳酸、醋酸、少量乙醇、礦物質(zhì)、維生素等次生代謝產(chǎn)物的液態(tài)或固態(tài)食品[2-3]。所含多種活性酶具有改善體內(nèi)微生態(tài)環(huán)境、潤腸通便、美容養(yǎng)顏和降血糖等功效[4]。 微生物酵素產(chǎn)品主要盛行于日本、美國、一些歐洲國家及東南亞地區(qū)，且形成了品牌產(chǎn)業(yè)規(guī)模，而近十多年來，在中國也開始盛行起來，越來越多的酵素理念被引入到農(nóng)業(yè)、食品、美容保健等領(lǐng)域[5-6]。

哈密瓜，古稱“甜瓜”，在我國的新疆、甘肅省的瓜州、敦煌等地都有大量的種植，而一些有疤痕、裂口、個(gè)頭不達(dá)標(biāo)的哈密瓜無法銷售，以廢棄物的形式堆棄在田間地頭，不僅是資源的浪費(fèi)，還造成環(huán)境污染。

以哈密瓜直接生產(chǎn)酵素產(chǎn)品鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以哈密瓜為原料，加入不同菌種進(jìn)行發(fā)酵，并通過實(shí)驗(yàn)探索不同菌種、接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間下的 pH、超氧化歧化酶(SOD)活性、羥自由基清除率、還原力來確定哈蜜瓜發(fā)酵制備酵素的最佳工藝條件。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)藥品、原料及儀器設(shè)備

實(shí)驗(yàn)藥品及原料：三羥甲基氨基甲烷(分析純)、鐵氰化鉀(分析純)，天津市光復(fù)精化研究所；乙二胺四乙酸(分析純)、鄰苯三酚(分析純)，上海市醫(yī)藥工業(yè)公司；三氯化鐵(分析純)、鄰二氮菲(分析純)、磷酸二氫鈉(分析純)、磷酸氫二鈉(分析純)、硫酸亞鐵銨(分析純)、過氧化氫(分析純)天津市福晨化學(xué)試劑廠；酵母菌(食品級)安琪酵母股份有限公司；乳酸菌(食品級)北京川秀科技有限公司；哈密瓜，張掖農(nóng)副市場。

實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備：TDL-5臺式離心機(jī)，常州翔天實(shí)驗(yàn)儀器廠；SHZ-D(III)循環(huán)水式真空泵，pHS-25pH計(jì),鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；400 W高壓汞燈,自制。

1.2 實(shí)驗(yàn)工藝

1.2.1 哈密瓜預(yù)處理

先使用高壓汞燈對工具、臺面進(jìn)行紫外線消毒，將挑選好的哈密瓜用蒸餾水清洗干凈，在無菌臺上去核去皮，切成小塊，備用。

1.2.2 發(fā)酵工藝的優(yōu)化

將新鮮切碎的哈密瓜分成5等份裝入玻璃錐形瓶中，并分別加入10%(哈蜜瓜質(zhì)量)的蔗糖。分別接種不同量的菌種，在保證發(fā)酵液充分溶氧的條件下，于30 ℃(或37 ℃)，發(fā)酵 48 h。在此期間，每隔3 h測每組實(shí)驗(yàn)的pH、超氧化歧化酶(SOD)活性、羥自由基清除率、還原力以確定哈蜜瓜發(fā)酵制備酵素的最佳工藝條件。

1.2.3 酵素性能的測定方法

1.2.3.1 pH值得的測定

用pH計(jì)測發(fā)酵液的pH值，測量前將pH計(jì)用標(biāo)準(zhǔn)液調(diào)至標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.3.2 還原力的測定(鐵氰化鉀還原法)

取不同階段樣品2.5 mL于試管中，先后加入2.5 mL 濃度為0.2 mol/L 的磷酸緩沖液(pH=6.6)和2.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的鐵氰化鉀溶液充分混勻，置于50 ℃水浴反應(yīng)20 min，結(jié)束后迅速冰浴冷卻并加入2.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的三氯乙酸混勻，在3000 r/min 條件下離心10 min，吸取上清液5 mL置于另一試管內(nèi)依次加入 4 mL 蒸餾水和1 mL濃度為1%的三氯化鐵溶液，充分混勻后反應(yīng)10 min，于700 nm波長處測定反應(yīng)液吸光度，吸光度越大表明還原力越強(qiáng)，(蒸餾水做空白)。同時(shí)以相同濃度的Vc為陽性對照。

1.2.3.3 羥自由基清除力的測定(鄰二氮菲法)[7]

按表1加樣后，混合均勻，用超級恒溫水浴控制溫度在 37 ℃保溫 1 h，于 536 nm 處測定吸光值A(chǔ)樣品。同一測定重復(fù)3次。

表1 羥自由基清除力測定的加樣量Table 1 Sampling amount for determination of hydroxyl radical scavenging power

羥自由基清除率=(A樣品- A損)/(A空白- A損)×100%

式中，A樣品：緩沖液+ FeSO4+鄰二氮菲+樣品+ H2O2；A空白：緩沖液+ FeSO4+鄰二氮菲；A損傷：緩沖液+ FeSO4+鄰二氮菲+ H2O2。

1.2.3.4 鄰苯三酚自氧化法測定超氧化歧化酶(SOD)活性[8-9]

用超級恒溫水浴控制溫度在25 ℃，按表2的加樣量，以Tris-HCl緩沖溶液為空白對照，在325 nm波長下每隔30 s測一次A0、AS共測6次。

表2 SOD活性測定加樣量Table 2 Determination of SOD activity by adding samples

在此條件下，每鐘抑制鄰苯三酚自氧化率50%的酶量定為1個(gè)活力單位。

抑制率=(A0-AS)/AS×100%

SOD單位活力(U/mL)=[(A0-AS)/AS]/50%×反應(yīng)總體積×(樣品稀釋倍數(shù)/樣液體積)

式中：A0：自氧化速率；AS：加入樣液后氧化速率。

2 結(jié)果與討論

2.1 酵母菌接種量的確定

接種不同量酵母菌(配比如表3所示)于30 ℃[10]，發(fā)酵 48 h，發(fā)酵液pH變化。

表3 酵母菌接種量表Table 3 Yeast inoculation scale

由圖1可以看出隨著酵母菌接種量的增大，發(fā)酵液的pH值下降越快，下降到最低pH值時(shí)也不容易回升。接種量在0.02%和0.05%時(shí)在24 h時(shí)降到最低，隨后一直處于緩慢的上升狀態(tài)中，而接種量為0.1%、0.15%和0.2%時(shí)pH下降很快，幾乎在9～15 h時(shí)發(fā)酵完成，發(fā)酵過程中有氣泡產(chǎn)生，發(fā)酵不穩(wěn)定，風(fēng)味不佳。因此，酵母菌發(fā)酵的最佳接種量為0.02%。

圖1 接種不同量酵母菌下發(fā)酵液的pH變化Fig.1 pH changes of fermentation broth inoculated with different amounts of yeast

2.2 乳酸菌接種量的確定

接種不同量乳酸菌(配比如表4所示)于37 ℃，發(fā)酵48 h，發(fā)酵液pH變化。

表4 乳酸菌接種量Table 4 Inoculation amount of lactic acid bacteria

由圖2看出pH一直處于下降階段，接種量在0.2%和0.5%時(shí)在21～24 h時(shí)降到最低，隨后處于緩慢的上升狀態(tài)中，而接種量為1%、1.5%和2%時(shí)pH下降過快，幾乎在6～12 h時(shí)發(fā)酵完成，發(fā)酵過程中有起泡產(chǎn)生，酸味強(qiáng)烈。因此，乳酸菌發(fā)酵的最佳接種量為0.02%。

圖2 接種不同量乳酸菌下發(fā)酵液的pH變化Fig.2 pH changes of fermentation broth inoculated with different amounts of lactic acid bacteria

2.3 發(fā)酵時(shí)間的確定

分別在三種條件下(配比如表5所示)，發(fā)酵48 h，發(fā)酵液pH、超氧化歧化酶(SOD)活性、羥自由基清除率、還原力的變化。

表5 不同菌種下的原料配比Table 5 Raw material ratio under different strains

2.3.1 發(fā)酵液pH變化

由圖3可知哈密瓜酵素的 pH 在前24～27 h一直處于下降過程，之后一直處于緩慢的上升過程，發(fā)酵前 27 h 是由于酵母菌在無氧條件下產(chǎn)生乙醇和二氧化碳，發(fā)酵液中由于二氧化碳濃度上升，碳酸濃度也隨之上升，而乳酸菌利用糖產(chǎn)生乳酸，因此pH值都下降。27 h后pH值處于緩慢上升，是由于微生物對發(fā)酵液中蛋白質(zhì)水解和氨基酸的利用，產(chǎn)生乙酸及其它有機(jī)酸的共同作用結(jié)果[11]。酵母菌在27 h時(shí)的pH為3.72，酵母菌在27 h時(shí)pH為3.92，而雙菌在24 h時(shí)pH最低為4.7，風(fēng)味最佳。

圖3 發(fā)酵過程中pH的變化Fig.3 Changes in pH during fermentation

2.3.2 發(fā)酵液SOD活性的變化

由圖4可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，SOD 活性一直處于上升階段，酵母菌或乳酸菌單菌在27 h時(shí)達(dá)到最大值后都趨于平緩，雙菌是30 h時(shí)達(dá)到最大值后開始下降，但三種工藝的SOD的變化差別不是很明顯。

圖4 發(fā)酵過程中SOD的變化Fig.4 Changes of SOD during fermentation

2.3.3 發(fā)酵液羥自由基清除率的變化

羥自由基屬活性氧中的一種，可降解多糖、DNA和細(xì)胞膜等，是體內(nèi)的強(qiáng)氧化，具有強(qiáng)氧化能力，在體內(nèi)可與金屬離子發(fā)生氧化，使金屬離子形成高氧化態(tài)，促進(jìn)人體衰老過程。羥自由基清除率利用顯色反應(yīng)，在536 nm處有最大吸收。

由圖5可看出，隨著發(fā)酵時(shí)間的增長，三種工藝的發(fā)酵液的羥自由基清除率呈現(xiàn)不斷上升的趨勢，在27～30 h 時(shí)羥自由基清除率達(dá)到最大，之后緩慢下降并趨于平緩，雙菌發(fā)酵液的羥自由基清除率明顯高于乳酸菌和酵母菌。分析原因可能是由于雙菌中乳酸菌和酵母菌相互作用：乳酸菌將糖原分解成半乳糖和葡萄糖這些易于吸收的單糖，為酵母菌提供碳源[12]。并且有研究發(fā)現(xiàn)酵母菌和乳酸菌自身具有抗氧化能力，酵母菌的細(xì)胞壁多糖能夠清除超氧陰離子自由基和羥自由基等活性氧[13]。故根據(jù)發(fā)酵過程中自由基清除率的變化，雙菌發(fā)酵工藝較優(yōu)。

圖5 羥自由基清除率的變化Fig.5 Changes of hydroxyl radical scavenging rate

2.3.4 發(fā)酵液還原力的變化

一種物質(zhì)的還原能力的大小反映其抗氧化活性的大小。

由圖6看出，還原力一直處于上升階段，說明隨著發(fā)酵的進(jìn)行發(fā)酵液中抗氧化成分增加，時(shí)也可以從圖6看出酵母菌、乳酸菌和雙菌的發(fā)酵最佳時(shí)間為 27～30 h。三種發(fā)酵工藝的發(fā)酵液還原力變化趨勢差別不明顯。

圖6 發(fā)酵過程中還原力的變化Fig.6 Changes in reducing power during fermentation

3 結(jié) 論

通過綜合分析各種情況下哈密瓜發(fā)酵工藝中的 pH 、還原力、羥自由基清除率、超氧化歧化酶(SOD)活性得出的結(jié)論是雙菌發(fā)酵的效果比單菌酵母菌或乳酸菌的更好，探索優(yōu)化的最佳哈密瓜發(fā)酵制備酵素的工藝參數(shù)為：在切碎哈密瓜中加入10%(哈密瓜量，下同)的蔗糖，20%的去離子水，0.02%的酵母菌接種量，0.2%乳酸菌接種量，在 30 ℃下，發(fā)酵 27 h，得到的哈密瓜酵素原液還原力最高，pH為4.5～5，羥自由基清除率>85%，超氧化歧化酶(SOD)單位活力>110 U/mL(110000 U/L)。本實(shí)驗(yàn)探索優(yōu)化的哈密瓜發(fā)酵制備酵素工藝為工業(yè)加工生產(chǎn)哈密瓜酵素產(chǎn)品提供一定的參考。