◎ 曾曉琮，陳茵茵，韓志杰，蘇章庭，周 露

（廣東省食品檢驗所，廣東 廣州 510435）

食物過敏是指過敏原蛋白引起人體異?；虺５拿庖叻磻?yīng)，已成為備受關(guān)注的全球性公眾健康和食品安全問題。近日，中國疾控中心英文周報發(fā)表了一系列關(guān)于中國人食物過敏的研究論文，對我國不同人群的食物過敏情況進行了詳細分析，研究結(jié)果表明我國食物過敏的患病率呈上升趨勢。據(jù)報道[1]，嬰兒的食物過敏率在歐洲和美國是1%～5%，在中國是7%，在澳大利亞則超過10%。植物蛋白類食品因為“天然、綠色、營養(yǎng)、健康”等特點受到人們的喜愛，但另一方面，植物類過敏原食品安全問題也受到越來越多關(guān)注[2]?！额A(yù)包裝食品中的致敏原成分》（GB/T 23779—2009）和《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 預(yù)包裝食品標(biāo)簽通則》（GB 7781—2011）規(guī)定了4類可能導(dǎo)致過敏反應(yīng)的植物性食品及其制品。①含有麩質(zhì)的谷物及其制品（如小麥、黑麥、大麥、燕麥、斯佩耳特小麥或它們的雜交品系）。②花生及其制品。③大豆及其制品。④堅果及其果仁類制品。植物類過敏原可引起不同的癥狀，如麩質(zhì)過敏可能導(dǎo)致口部咽喉部蕁麻疹，鼻塞、頭痛，呼吸困難，惡心嘔吐，腹瀉；花生過敏可能導(dǎo)致血壓降低，面部喉嚨腫脹，嚴重時引起過敏性休克；大豆過敏可能引起皮膚紅癢，哮喘及過敏性鼻炎、腹痛腹瀉；堅果過敏可能引起口中產(chǎn)生金屬味道、舌頭或喉水腫大、呼吸困難、吞咽困難、全身蕁麻疹、痙攣性腹痛、惡心[2]。目前對于過敏疾病尚無有效治療手段，避免攝入含過敏原食物仍是最有效的預(yù)防方式，采用高效的檢測技術(shù)對確保食品標(biāo)簽準(zhǔn)確具有重要意義。

過敏原檢測主要有基于蛋白水平的免疫學(xué)技術(shù)和基于基因水平的分子生物學(xué)技術(shù)，兩種技術(shù)各有長處。我國現(xiàn)有過敏原檢測標(biāo)準(zhǔn)有出口食品過敏原成分檢測系列標(biāo)準(zhǔn)和出口食品常見過敏原LAMP系列檢測方法系列標(biāo)準(zhǔn)，在41個標(biāo)準(zhǔn)中有39個標(biāo)準(zhǔn)介紹核酸檢測方法，2個標(biāo)準(zhǔn)介紹免疫學(xué)方法，基于標(biāo)準(zhǔn)大部分介紹核酸檢測方法，但都是針對單一過敏原的現(xiàn)狀，本文著重綜述植物類食物過敏原多重核酸檢測技術(shù)，包括多重PCR技術(shù)、基因芯片技術(shù)、宏基因測序技術(shù)，以期為植物類食品過敏原檢測標(biāo)準(zhǔn)研發(fā)及食品安全風(fēng)險防控提供參考。

1 多重PCR技術(shù)

多重PCR技術(shù)是指針對食品中多種成分的目的基因，設(shè)計引物組合，在一個反應(yīng)體系中計入2對或2對以上的特異性引物，分別擴增不同目的基因，實現(xiàn)同時檢測多個目的基因[2]。

PAFUNDO等[3]結(jié)合SYBR?GreenER?技術(shù)建立腰果、扁桃仁、芝麻、花生、榛子的5重qRT-PCR方法，檢測靈敏度達0.5 pg DNA，定量標(biāo)準(zhǔn)曲線R2＝0.999 8。王瑋[4]根據(jù)芝麻2S albumin mRNA基因、燕麥Avenin基因、胡桃Jug r 2基因、榛果Oleosin基因、杏仁Pru du 1基因芥末Sin a I基因、芹菜Mtd基因、羽扇豆核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）基因設(shè)計引物，采用2組4重PCR擴增，建立了芝麻、燕麥、胡桃、榛果、杏仁、芥末、芹菜、羽扇豆8重qRT-PCR方法，檢測限為100 pg。程芳[5]建立了針對美洲山核桃、大豆、小麥、大麥、榛子、腰果、花生、芝麻、燕麥、開心果10重普通PCR方法，結(jié)合毛細管電泳，檢測靈敏度達20 copies，能檢出含量在10.000%、5.000%、2.000%、1.000%、0.500%、0.100%、0.050%、0.010%、0.005%范圍的過敏原。汪永信等[6]根據(jù)大豆atp A基因和芹菜mtd基因設(shè)計引物，建立TaqMan探針qRT-PCR方法，同時檢測大豆和芹菜，對大豆、芹菜、花生、芝麻、玉米、大米、小麥、大麥、馬鈴薯、杏仁、蘋果、蕃茄、核桃、葵花籽、開心果、腰果、梨、草莓、羊肉、魚肉、豬肉、牛肉等材料進行檢測，僅大豆和芹菜出現(xiàn)特異性擴增，檢出限為0.01%。PIERBONI[7]根據(jù)大豆的Glym3、Glym5、Lectin基因和花生的Arah1、Arah2基因設(shè)計引物，建立了同時檢測大豆和花生的數(shù)字PCR方法，并與qRT-PCR和ELISA作對比研究。蘭海鷗[8]針對花生Ara hl基因、核桃Tugr 1基因、大豆Gly m Bd 28k基因設(shè)計引物，建立花生、核桃、大豆三重qRT-PCR方法，拷貝數(shù)最低檢測限為花生1.50×103copies·μL-1、 核 桃 1.50×102copies·μL-1、大豆 1.50×102copies·μL-1。最低檢測限為花生 1 ng·μL-1DNA、 核 桃 0.1 ng·μL-1DNA、 大 豆 0.01 ng·μL-1DNA。王鳴秋[9]建立榛子、核桃、花生、杏仁、大豆、芝麻的六重過敏原成分檢測方法，根據(jù)多拷貝ITS基因，設(shè)計6組特異性雜交探針，對20多種相關(guān)植物、動物及微生物進行多重連接探針擴增，特異性強，檢出限為5 mg·kg-1，并通過30份不同種類食品樣品驗證?？卵嗄萚10]根據(jù)小麥ω-醇溶谷蛋白（ω-gliadin）、大麥醇溶谷蛋白（Hordein）、黑麥ω-黑麥堿蛋白（ω-secalin）基因序列設(shè)計引物，建立同時檢測小麥、大麥和黑麥致敏原（WBR155 bp）的普通PCR方法，3種過敏原檢出限分別為1.00%、0.01%、0.10%，對14份樣品進行檢測，結(jié)果均與標(biāo)簽標(biāo)識相符合。

加工食品可能存在多種過敏原成分，相比單重PCR技術(shù)，采用多重PCR技術(shù)具有顯著的高效性，保留了傳統(tǒng)PCR特異性強、靈敏度高的特點，也節(jié)約了反應(yīng)時間和試劑用量，是一種既經(jīng)濟又高效的高通量檢測方法，但難度在于多對引物在同一體系內(nèi)對不同目的片段進行擴增，準(zhǔn)確擴增依賴于引物設(shè)計、反應(yīng)溫度、循環(huán)條件、離子強度等條件設(shè)計，設(shè)計好引物探針是反應(yīng)成功的關(guān)鍵，不合理的設(shè)計容易形成引物二聚體或非特異性擴增，造成假陽性。在遵循引物設(shè)計主要原則的基礎(chǔ)上，各引物對之間的最佳退火溫度應(yīng)盡可能相同且無任何交互反應(yīng)。

2 基因芯片技術(shù)

基因芯片技術(shù)是將引物探針與芯片結(jié)合，將預(yù)先設(shè)計好的探針固化在芯片基質(zhì)上，通過核酸分子雜交，檢測每個雜交信號，獲知樣品的分子數(shù)量和序列信息[34]。BETTAZZI[11]針對榛子Cora 1.04 和Cora 1.03基因設(shè)計引物，建立基于低密度DNA微陣列檢測方法，檢測限分別可達 0.3 nmol·L-1和 0.1 nmol·L-1。WANG[12]建立了快速檢測腰果、蝦、魚、牛肉、雞、大豆、小麥和花生8種過敏原的基因芯片技術(shù)，腰果DNA的絕對檢出限為0.05 pg，實際檢出限為0.001%，PCR擴增后生物傳感器芯片檢測時間約為30 min。DAN[13]建立同時檢測榛子、花生、大豆過敏原的可視化基因芯片技術(shù)，先將LAMP擴增引物固定于芯片基質(zhì)中，同時加入酸堿指示劑染料，當(dāng)檢出目的基因時，擴增體系pH值變化導(dǎo)致染料變色，由此被生物傳感器檢測放大，實現(xiàn)快速高通量檢測，檢出限達 0.4 μg·mL-1。

基因芯片技術(shù)靈敏度高、特異性強，檢驗周期短，通過擴增曲線判定檢測結(jié)果的方式可以滿足可視化的要求，快速簡易，適用于現(xiàn)場的即時檢測，多重引物探針與微流控的組合是基因芯片技術(shù)的難點和重點。

3 宏基因測序技術(shù)

多重PCR技術(shù)和基因芯片技術(shù)可以實現(xiàn)多重過敏原靶基因檢測，大大提高了檢測效率，但不足之處是僅針對已知的過敏原靶基因定向檢測，對于未知的過敏原則無法檢測。到目前為止，有超過989種蛋白被世界衛(wèi)生組織和國際免疫聯(lián)合協(xié)會認定為過敏原蛋白[14]。盡可能篩選識別出過敏原，實現(xiàn)非靶向檢測，現(xiàn)有多重技術(shù)還遠遠不夠。隨著基因測序技術(shù)的發(fā)展，高通量測序技術(shù)（High-Throughput Sequencing，HTS）又稱下一代測序技術(shù)（Next Generation Sequencing，NGS），以協(xié)同方式逐步進行酶促DNA反應(yīng)、堿基測序與數(shù)據(jù)收集，可以同時完成數(shù)萬條到數(shù)十億條DNA模板的測序。NGS技術(shù)目前較多應(yīng)用于摻雜摻假、微生物非靶向檢測，在過敏原非靶向檢測中較少。WANG[1]研究了一種雜交探針簇靶向的下一代測序（HPC-NGS）技術(shù)，用于高通量篩選食品系統(tǒng)中的潛在過敏原，研究收集了過敏原的公共序列以設(shè)計特定的探針簇，以從植物和動物來源的高通量宏基因組測序讀數(shù)中準(zhǔn)確識別過敏原成分，通過HPCNGS成功捕獲了目標(biāo)DNA片段，并在復(fù)雜的食品系統(tǒng)中鑒定了19種致敏成分，HPC-NGS在單一食品材料中的過敏原物種匹配率為94.24%～100.00%，在加工食品中的過敏原物種匹配率為99.87～99.98%。

4 結(jié)語

食品加工多元化帶來了食品品質(zhì)的提升，但也可能在生產(chǎn)過程中帶入了食品過敏原潛在風(fēng)險。在食品加工過程中，食品蛋白質(zhì)容易出現(xiàn)變性、聚集現(xiàn)象，導(dǎo)致其線性表位及構(gòu)象表位發(fā)生改變，采用基于蛋白水平過敏原檢測技術(shù)容易出現(xiàn)假陰性或假陽性，過敏蛋白相互間還可能會交叉免疫，相比之下，核酸水平分子生物學(xué)檢測技術(shù)在食品檢驗檢測領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，核酸檢測針對過敏原DNA，不易受到外界條件的影響，可避免近緣物種的交叉反應(yīng)，更加便捷、有效。食品過敏原核酸檢測技術(shù)從普通PCR發(fā)展到qRT-PCR、數(shù)字PCR，從單重檢測發(fā)展到多重檢測。目前，生物芯片技術(shù)成為研究熱點，由于采用反向雜交技術(shù)，可實現(xiàn)單一樣品多種過敏原同時檢測、多個樣品多種過敏原的高通量檢測，值得研究推廣。此外，從過敏原核酸檢測技術(shù)研究可以看出，對過敏原基因的氨基酸序列進行生物信息學(xué)分析是開發(fā)過敏原檢測技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，因此，不斷積累過敏原信息數(shù)據(jù)對未來開發(fā)更加高效的過敏原檢測技術(shù)和食品過敏原風(fēng)險防控具有重要意義。NGS能實現(xiàn)高通量非靶向性檢測，將有利于篩查食物中的潛在過敏原，有利于解決食品中未知過敏原風(fēng)險檢測篩查，值得進一步研究。