蘇艷秋,孫曉娜,指導(dǎo)老師:孫 彬

（1.河南中醫(yī)藥大學(xué),河南 鄭州 450002;2.河南省中醫(yī)院/河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院,河南 鄭州 450002）

肝纖維化（hepatic fibrosis,HF）在組織學(xué)上被定義為以纖維化和正常肝臟結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)榻Y(jié)構(gòu)異常結(jié)節(jié)為特征的彌漫性過(guò)程,是慢性肝病發(fā)展至肝硬化的持續(xù)性進(jìn)展過(guò)程,是肝硬化的前期病變,因此能否減緩或逆轉(zhuǎn)肝纖維化進(jìn)程在臨床上具有重要意義。流行病學(xué)資料表明,肝硬化是成年人死亡的常見原因之一[1]。根據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)顯示,目前因肝硬化（肝纖維化）住院的人數(shù)占內(nèi)科住院人數(shù)的十分之一左右,其病死率僅次于癌癥。肝纖維化的發(fā)病率較高,已經(jīng)嚴(yán)重影響人類生活質(zhì)量及生命健康。實(shí)脾軟肝丸是孫彬教授在多年臨床實(shí)踐基礎(chǔ)上擬定的驗(yàn)方。本研究通過(guò)建立小鼠肝纖維化模型,觀察實(shí)脾軟肝丸對(duì)小鼠肝纖維化程度的影響,并探究不同實(shí)脾軟肝丸濃度下小鼠血清ALT、AST含量的變化,以及Smad2、TGF-βⅠ、PDGF等因子的表達(dá),探究其作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物 雄性健康Balb/c小鼠30只,體質(zhì)量（20±2）g,SPF級(jí),9周齡以上,由河南中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室提供,合格證號(hào):SCXK（豫）2019-0002號(hào)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理研究審批號(hào)為1112號(hào)。

1.2 藥物 實(shí)脾軟肝丸藥物組成:黨參片15 g,白術(shù)15 g,茯苓15 g,薏苡仁20 g,醋鱉甲6 g,醋龜甲6 g,炒雞內(nèi)金30 g,醋三棱10 g,醋莪術(shù)10 g,延胡索10 g,香附10 g,柴胡10 g,桂枝6 g,甘草片6 g。藥物飲片均來(lái)自河南中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院門診中藥房制劑中心,分別煎成濃度為0.5 g/m L、2 g/m L的藥液,水飛薊賓膠囊（天津天士力圣特有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字H20040299,35 mg/粒）。

1.3 試劑與儀器 CCL4溶液（上海麥克林生化科技有限公 司,批 號(hào):C805329）,ALT、AST、Smad2、TGF-βⅠ、PDGF酶聯(lián)免疫吸附ELISA試劑盒（武漢博士德公司,批號(hào):EK5486）,LEICARM型石蠟切片機(jī)（德國(guó)萊卡公司）,電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）,BX50生物顯微器（日本Olympus公司）,臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器股份公司）,酶標(biāo)檢測(cè)儀（美國(guó)BioTek）。

2 方法

2.1 制備小鼠肝纖維化模型及給藥方法 將30只Balb/c雄性小鼠常規(guī)飼養(yǎng)7 d后,隨機(jī)分為空白組、模型組、實(shí)脾軟肝丸低劑量組、實(shí)脾軟肝丸高劑量組、水飛薊賓膠囊組,每組6只。除空白組外,其余各組用20%CCL4 1 m L/kg橄欖油溶液腹腔注射制備肝纖維化模型,每周注射2次,每次注射劑量為藥物濃度×小鼠體質(zhì)量,每周配制1次腹腔注射液。實(shí)脾軟肝丸低、高劑量組造模的同時(shí)分別給予實(shí)脾軟肝丸水煎濃縮液5 g/（kg·d）、20 g/（kg·d）灌胃治療,水飛薊賓膠囊組造模的同時(shí)給予17.5 mg/（kg·d）灌胃治療,空白組、模型組給予等量的0.9%氯化鈉注射液灌胃,每日灌胃1次,共干預(yù)8周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后用摘取眼球法收集血液,分離血清,將取血后的小鼠處死后解剖,取肝臟置于－80℃冰箱中備用。

2.2 檢測(cè)指標(biāo)

（1）小鼠體質(zhì)量 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,分別對(duì)5組小鼠稱重,記錄數(shù)據(jù)后統(tǒng)計(jì)分析,比較各組體質(zhì)量變化。

（2）肝組織病理檢測(cè) 取各組小鼠肝臟,分別進(jìn)行切片、HE染色,在顯微鏡下觀察并拍攝照片,在光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟組織病理學(xué)形態(tài)改變情況。

（3）小鼠血清中ALT、AST含量及Smad2、TGF-βⅠ、PDGF因子表達(dá)水平 將小鼠血液靜置2 h后用離心機(jī)以3 000 r/min離心,取上清液,用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒檢測(cè)ALT、AST含量及Smad2、TGF-βⅠ、PDGF的表達(dá)。

（4）統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)錄入SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件中,計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示,組間采用最小顯著性差異法（LSD）檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 體質(zhì)量變化 實(shí)驗(yàn)前后記錄每組小鼠體質(zhì)量變化,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,空白組、水飛薊賓膠囊組、實(shí)脾軟肝丸低劑量組及高劑量組的小鼠體質(zhì)量較治療前增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）,模型組小鼠體質(zhì)量較治療前減少,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 5組小鼠干預(yù)前后體質(zhì)量比較（g,±s）

表1 5組小鼠干預(yù)前后體質(zhì)量比較（g,±s）

注:與干預(yù)前比較,△P＜0.05。

組別 空白組 模型組 水飛薊賓組實(shí)脾軟肝丸低劑量組實(shí)脾軟肝丸高劑量組干預(yù)前 19.50±1.51 19.74±1.49 20.50±1.56 20.14±1.50 19.66±1.49干預(yù)后 22.50±1.74△ 19.44±1.54 21.86±1.45△ 22.50±1.52△ 22.97±1.46△

3.2 病理結(jié)果 干預(yù)8周后處死小鼠,取小鼠肝臟切片后進(jìn)行HE染色,鏡下病理結(jié)果顯示:實(shí)脾軟肝丸可有效改善肝纖維化程度。見圖1（見本期第125頁(yè)）。

圖1 5組小鼠病理結(jié)果（×200）

3.3 ALT、AST、Smad2、TGF-βⅠ、PDGF因子表達(dá)水平實(shí)脾軟肝丸可以通過(guò)抑制小鼠ALT、AST、Smad2、TGF-βⅠ、PDGF的表達(dá),降低肝纖維化水平,減輕肝損傷。見圖2、圖3。

圖2 轉(zhuǎn)錄激活因子（Smad2）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF-βⅠ）的表達(dá)

圖3 谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）血小板衍生因子（PDGF）的表達(dá)

4 討論

肝纖維化是由多種致病因子所致的肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生,導(dǎo)致肝內(nèi)彌漫性細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積的一個(gè)病理過(guò)程,最終可發(fā)展為肝硬化和肝癌[2-4]。目前尚無(wú)治療肝纖維化的特效藥物,但已有研究認(rèn)為中醫(yī)藥治療肝纖維化有較大的優(yōu)勢(shì)和發(fā)展前景。水飛薊賓膠囊是治療肝纖維化的一種中成藥制劑,其中的有效成分水飛薊賓可以清除肝細(xì)胞內(nèi)的活性氧自由基,穩(wěn)定肝細(xì)胞膜,保護(hù)肝細(xì)胞酶系統(tǒng),因此本實(shí)驗(yàn)選用水飛薊賓膠囊作為對(duì)照治療用藥。本研究通過(guò)制備小鼠肝纖維化模型,分別給予實(shí)脾軟肝丸低、高劑量濃縮煎劑及水飛薊賓膠囊溶液灌胃干預(yù),實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,實(shí)脾軟肝丸可能通過(guò)降低小鼠體內(nèi) ALT、AST、Smad2、TGF-βⅠ、PDGF含量以減輕甚至逆轉(zhuǎn)小鼠肝纖維化的形成過(guò)程。

肝纖維化的形成受多種因素的影響,慢性肝炎病毒感染、酒精、藥物與毒物、血吸蟲、代謝和遺傳、膽汁淤積、自身免疫性肝病等均是肝纖維化的易感因素[4]。相關(guān)文獻(xiàn)表明,在肝纖維化形成過(guò)程中,有多種因子參與其中,研究主要集中在Smad2、TGF-βⅠ、PDGF等因子[4-5]。Smad2、TGF-βⅠ等細(xì)胞因子是介導(dǎo)肝纖維化形成的中間物質(zhì),可以促進(jìn)肝星狀細(xì)胞活化,調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)分化,促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）合成[6-8],其過(guò)程具體如下:TGF-βⅠ肝細(xì)胞膜上的TGF-βⅡ型受體結(jié)合,引發(fā)TGF-βⅠ型受體磷酸化;隨之Ⅰ型受體磷酸化激活Smad2或Smad3;磷酸化的Smad2、Smad3與Smad4形成三聚體,進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)節(jié)目的基因表達(dá)[9-10],這些目的基因不僅包括參與肝纖維化形成的基因,還包括自噬相關(guān)基因Beclin-1[11-12]。當(dāng)活化的肝星狀細(xì)胞分泌TGF-βⅠ后,經(jīng)TGF-βⅠ/Smads通路傳導(dǎo)促進(jìn)Ⅰ型膠原蛋白、α-SMA和金屬蛋白酶組織抑制因子1（TIMP1）的表達(dá),抑制基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP2）的表達(dá),使TIMP1/MMP2比值升高,導(dǎo)致ECM大量生成和肝纖維化。PDGF為血小板衍生因子,由庫(kù)弗細(xì)胞（KC）和竇內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生,可以強(qiáng)烈趨化肝星狀細(xì)胞（HSC）,調(diào)節(jié)HSC的活化、增殖、ECM的降解,導(dǎo)致旁分泌激活肝細(xì)胞的保護(hù)或凋亡信號(hào)傳導(dǎo)途徑,形成肝纖維化,增強(qiáng)肝臟損傷[13]。

實(shí)脾軟肝丸為孫彬教授多年臨床經(jīng)驗(yàn)自擬方,本方以四君子湯為基礎(chǔ)方加減而成,即黨參、白術(shù)、茯苓為君藥,可益氣健脾,扶助正氣;柴胡、延胡索、香附為臣藥,入肝經(jīng),可疏肝理氣,化瘀止痛,且柴胡又有升陽(yáng)解郁之功,助藥力遍布全身;薏苡仁、炒雞內(nèi)金健益脾胃,利濕化水,增強(qiáng)脾胃運(yùn)化之力;佐以鱉甲、龜甲軟肝散結(jié);三棱、莪術(shù)、桂枝、甘草均為使藥,可活血破血逐瘀,消積散結(jié)止痛。全方共奏益氣健脾、疏肝理氣、活血化瘀散結(jié)之功。

現(xiàn)代藥理研究表明,黨參煎劑可以有效降低小鼠體內(nèi)血清ALT、堿性磷酸酶（ALP）水平,抑制炎癥進(jìn)程[14];白術(shù)中的白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和白術(shù)多糖可以抑制細(xì)胞增殖,從而起到抗腫瘤的作用,另外還可以抗炎、抗氧化,調(diào)節(jié)胃腸道功能[15];茯苓提取物茯苓多糖不僅可以降低小鼠炎癥細(xì)胞因子水平,還有保肝降酶、減輕肝損傷的作用[16];柴胡皂苷能夠增強(qiáng)肝纖維化大鼠肝臟內(nèi)的超氧化物歧化酶活性,降低Ⅳ型膠原、層粘連蛋白、透明質(zhì)酸及肝酶含量,從而達(dá)到抗纖維化的作用[17];相關(guān)文獻(xiàn)表明,鱉甲可以下調(diào)大鼠Smads、TGF-βⅠ水平,有效抑制其表達(dá),延緩大鼠肝纖維化的形成[18]。

本研究結(jié)果證實(shí),實(shí)脾軟肝丸可以有效降低ALT、AST 水平,抑制Smads、TGF-βⅠ、PDGF因子的表達(dá),有效抗肝纖維化,減輕肝損傷,延緩肝硬化進(jìn)程,說(shuō)明實(shí)脾軟肝丸在治療肝纖維化、保肝降酶等方面療效顯著。