孫國祝，路 萌，王決恒，周宇荀，李 凱，肖君華

(東華大學(xué) 化學(xué)化工與生物工程學(xué)院， 上海 201620)

線粒體拷貝數(shù)變異與許多年齡相關(guān)疾病有關(guān)，包括代謝綜合征、神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病和癌癥等。檢測線粒體拷貝數(shù)變化對于揭示細(xì)胞衰老進(jìn)程以及評估個(gè)體健康水平有重要意義[1]。熒光定量PCR(polymerase chain reaction)技術(shù)是目前主要檢測線粒體拷貝數(shù)的方法，具有快速、高通量且易于使用和分析等優(yōu)點(diǎn)[2-5]。多重?zé)晒舛縋CR技術(shù)要求內(nèi)參基因和目的基因的拷貝數(shù)在相同數(shù)量級，從而保障檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。據(jù)文獻(xiàn)[6]報(bào)道，每個(gè)細(xì)胞中含有幾百至上千拷貝的線粒體DNA。本研究從基因組數(shù)據(jù)庫中尋找一個(gè)高拷貝(300拷貝)基因作為內(nèi)參基因，命名為YH-1。與單拷貝內(nèi)參基因相比，高拷貝內(nèi)參基因減少了與線粒體DNA拷貝數(shù)的倍數(shù)差異。同時(shí)，建立并優(yōu)化了雙色熒光定量PCR方案(雙TaqMan探針法)來檢測線粒體和內(nèi)參基因的拷貝數(shù)，該方案實(shí)現(xiàn)了內(nèi)參基因和目的基因在同一管中檢測，提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，也可節(jié)約樣本。線粒體DNA與基因組DNA共存于細(xì)胞中，不同于基因組DNA，線粒體DNA呈環(huán)狀，兩者長度大小懸殊，導(dǎo)致在總DNA抽提過程中會(huì)影響線粒體DNA得率，進(jìn)而影響線粒體DNA拷貝數(shù)的檢測。所以本文比較了瓊脂糖包塊法、磁珠法、試劑盒法以及酚-氯仿法等不同總DNA抽提方案對線粒體DNA拷貝數(shù)檢測影響[7-8]，同時(shí)構(gòu)建了穩(wěn)定的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品用以檢測方案。利用該方案，隨機(jī)檢測了不同年齡段100例血樣，結(jié)果表明線粒體DNA拷貝數(shù)與年齡呈負(fù)相關(guān)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

DNA血樣采集于上海松江區(qū)中心醫(yī)院志愿者(所有研究參與者均在自主自愿的前提下簽署了知情同意書)。7500 Real Time PCR System 購自美國 Applied Biosystems 公司;Probe qPCR Super Mix 購自近岸蛋白科技有限公司；磁珠法DNA提取試劑盒購自上海木辰生物科技有限公司；瓊脂糖購自上海翊圣生物科技有限公司；柱式血樣DNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，酚-氯仿DNA提取試劑盒購自上海翼和應(yīng)用生物技術(shù)公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取方法

使用4種不同方法進(jìn)行了細(xì)胞基因組DNA抽提：瓊脂糖包塊法、磁珠法、試劑盒法(過柱式)、酚-氯仿法等方法，操作步驟見相關(guān)說明書。

1.2.2 DNA樣本標(biāo)化

將上述4種不同提取方案所得DNA樣品稀釋至20 ng/μL，純度A260/A280≈1.8，其中，A260為DNA吸光度，A280為蛋白質(zhì)吸光度，取2 μL作為模板，進(jìn)行熒光定量 PCR反應(yīng)。

1.2.3 引物和探針設(shè)計(jì)

依照引探針物及探針設(shè)計(jì)原則，利用Prime 3.0和Oligo 7設(shè)計(jì)線粒體及YH-1特異性上下游引物及TaqMan探針。線粒體上游引物5′-CCGACCGTTGACTATTCT-3′、下游引物5′-CCGATTATGATGGGTATTACT-3′、YH-1上游引物5′-GAAAGTGAAGTAGGCCGGGC-3′、下游引物5′-GAAAGTGAAGTAGGCCGGGC-3；線粒體TaqMan探針5′CGCATGAGCTGGAGTCCTC-BHQ1-3′及YH-1TaqMan探針5′-CCACGCCTGTAATCCCAGC-BHQ1-3′。引物由蘇州泓迅生物科技有限公司合成，TaqMan探針由通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司合成。YH-1經(jīng)NCBI Blast比對結(jié)果顯示，其拷貝數(shù)為300，全長為200 bp。

1.2.4 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備

將外源內(nèi)參基因YH-1與線粒體擴(kuò)增片段連接到質(zhì)粒pUC57上構(gòu)建質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2.5 多重?zé)晒舛?PCR反應(yīng)檢測線粒體拷貝數(shù)

多重?zé)晒舛?PCR反應(yīng)體系總體積為 20 μL，其中近岸蛋白2×ProbeMix10 μL，ROX dyeⅡ0.4 μL，引物濃度稀釋至0.5 μmol/L，加樣2 μL。探針濃度稀釋至0.05 μmol/L，加樣2 μL；標(biāo)準(zhǔn)品DNA或檢測樣本基因組DNA加樣2 μL，加超純水至20 μL。使用ABI7500 Real Time PCR System定量檢測，反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min；循環(huán)條件為95 ℃變性15 s，58 ℃ 退火2 min，72 ℃延伸1 min，在72 ℃收集熒光信號，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。

1.3 試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

利用ABI軟件標(biāo)準(zhǔn)曲線建立功能，自動(dòng)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 線粒體拷貝數(shù)計(jì)算

應(yīng)用絕對定量法計(jì)算線粒體DNA的拷貝數(shù)，如式(1)所示。

線粒體DNA拷貝數(shù)=300/2-ΔΔCt

式中：ΔΔCt=(Ct線粒體-Ct核)樣品-(Ct線粒體-Ct核)質(zhì)粒，Ct為實(shí)時(shí)熒光定量PCR過程中擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)數(shù); 300為內(nèi)參基因YH-1的拷貝數(shù)。

1.3.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用GraphPad prism 5.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和繪圖。

1.4 應(yīng)用

對100例血液樣本(男性、女性各50例，分為5個(gè)年齡組20～30、31～40、41～50、51～60、61～70歲，每個(gè)年齡組男性、女性各10例)通過瓊脂糖包塊法提取基因組DNA來檢測線粒體拷貝數(shù)。

2 結(jié)果分析

2.1 高拷貝內(nèi)參基因在人群中拷貝數(shù)穩(wěn)定

為獲得可靠、準(zhǔn)確的檢測結(jié)果，要求內(nèi)參基因在人群中穩(wěn)定且沒有拷貝數(shù)差異。從基因組數(shù)據(jù)庫中篩選出的一段200 bp的基因組片段(300拷貝)作為新的內(nèi)參基因命名為YH-1，以100例人血液DNA樣本為模板進(jìn)行多重?zé)晒舛?PCR擴(kuò)增，利用單拷貝內(nèi)參基因36B4驗(yàn)證該內(nèi)參基因的穩(wěn)定性。試驗(yàn)結(jié)果表明：YH-1基因在人群中拷貝數(shù)穩(wěn)定(見圖1)，兩基因Ct值相差8.36，數(shù)值上符合拷貝數(shù)倍數(shù)差異；并且YH-1基因在男性和女性樣本中與內(nèi)參基因的差值(ΔCt)趨于相近。由此證明內(nèi)參基因YH-1在X染色體上沒有非特異性擴(kuò)增(見圖2)，可以作為穩(wěn)定的內(nèi)參基因。

圖1 利用內(nèi)參基因36B4驗(yàn)證YH-1基因在人群中穩(wěn)定性

圖2 YH-1基因在性染色體(X染色體)上擴(kuò)增情況

2.2 多重?zé)晒舛縋CR檢測線粒體的標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

5個(gè)濃度梯度線粒體樣品Ct值與樣本質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示。由圖3可知，線粒體Ct值與其質(zhì)量呈較好的線性關(guān)系(r2=0.995)，且擴(kuò)增效率為111.155%。標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為y=-3.081×lgx+23.677，其中，y為Ct值，x為線粒體標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量，ng。

圖3 多重?zé)晒舛縋CR檢測線粒體拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 細(xì)胞總DNA抽提方案比較

使用多重?zé)晒舛縋CR法檢測樣本線粒體DNA拷貝數(shù)，結(jié)果如表1所示。由表1可知：瓊脂糖包塊法能夠高效抽提出樣本總DNA，試劑盒法、磁珠方法次之，酚-氯仿抽提方案的效率最低；利用瓊脂糖包塊法抽提的樣本線粒體DNA拷貝數(shù)最多，提示該方法抽提線粒體DNA得率最高。

表1 不同方案抽提基因組DNA結(jié)果

2.4 樣本檢測

利用本文方案測定了100名20～70歲受試者的血細(xì)胞中線粒體DNA的拷貝數(shù)，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，隨著年齡的增長，線粒體拷貝數(shù)呈降低趨勢。在40歲之前，男性和女性的線粒體DNA拷貝數(shù)隨年齡變化沒有明顯的變化趨勢；40歲之后，線粒體DNA拷貝數(shù)隨年齡增長呈明顯下降，并且，女性線粒體拷貝數(shù)在同年齡段中稍高于男性。

圖4 線粒體DNA拷貝數(shù)與年齡的關(guān)系

3 結(jié) 語

本文設(shè)計(jì)了一種新型多重?zé)晒舛縋CR檢測線粒體DNA拷貝數(shù)的方案，該方案首次選用穩(wěn)定的多拷貝基因?yàn)閮?nèi)參，同時(shí)消除了檢測內(nèi)參基因與目的基因時(shí)的孔間差。試驗(yàn)結(jié)果表明，該檢測技術(shù)簡單易行、結(jié)果可靠，簡化檢測步驟以及節(jié)約樣本，適用于群體樣本檢測。利用該方案檢測了100例20～70歲受試者的血細(xì)胞中線粒體DNA的拷貝數(shù)，發(fā)現(xiàn)線粒體DNA拷貝數(shù)與年齡增長呈負(fù)相關(guān)。另外，不同的總DNA提取方法對線粒體DNA的得率也不同。研究發(fā)現(xiàn)，瓊脂糖包塊法抽提樣本總DNA效果最好，更適用于后續(xù)線粒體DNA拷貝數(shù)檢測研究?？偠灾?，更加精準(zhǔn)的線粒體拷貝數(shù)檢測方法能夠揭示線粒體拷貝數(shù)變化與衰老和疾病的關(guān)系，本文方法將為科研工作者提供一種更加可靠、方便的試驗(yàn)方案。