秦思民 劉蘇瑩 諸 穎 呂 敏

1（中國科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所中國科學(xué)院微觀界面物理與探測重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海 201800）

2（上海師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院 上海 200234）

3（中國科學(xué)院上海高等研究院基礎(chǔ)交叉研究中心張江實(shí)驗(yàn)室 上海 201210）

4（中國科學(xué)院大學(xué) 北京 100049）

細(xì)菌生物膜（Bacterial biofilm）是由細(xì)菌聚集體及其分泌的多糖、蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子形成的相互黏附的胞外基質(zhì)組成的類似膜結(jié)構(gòu)的復(fù)合物。細(xì)菌幾乎可以在所有天然或人造表面形成生物膜［1?2］。生物膜內(nèi)部的細(xì)菌相互接觸，特定的生物大分子相互作用，導(dǎo)致其表現(xiàn)出區(qū)別于自由懸浮細(xì)菌的獨(dú)特理化性質(zhì)。生物膜能保護(hù)內(nèi)部細(xì)菌免受外界環(huán)境的干擾，例如其他菌種的入侵、溫度的劇烈變化等，也讓細(xì)菌逃避抗生素作用從而產(chǎn)生抗性［3?5］，極大地危害人類的健康和安全。因此，早期對生物膜的研究主要集中在如何徹底去除生物膜或者抑制生物膜的生長，其中研究最多的是條件致病菌銅綠假單胞菌［6?9］。近年來，隨著人們對生物膜的深入研究，發(fā)現(xiàn)其對生產(chǎn)生活的正面作用，例如生物膜用于廢水處理［10］或者微生物燃料電池制備［11］等。如何調(diào)控生物膜的結(jié)構(gòu)性質(zhì)使其更加有效發(fā)揮有利功能，成為生物合成領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)［12?13］。

合成生物學(xué)旨在對生物系統(tǒng)進(jìn)行編程，以實(shí)現(xiàn)功能自定義化，即用DNA編碼特定基因表達(dá)特定蛋白質(zhì)或直接用蛋白質(zhì)序列來指導(dǎo)從亞細(xì)胞水平到個(gè)體水平的行為。利用合成生物學(xué)手段，通過設(shè)計(jì)基因電路來調(diào)節(jié)生物體的基因表達(dá)，從而合成具有特定功能的生物材料。細(xì)菌由于基因組簡單易改造，而生物膜又是細(xì)菌及其合成的一系列生物大分子的復(fù)合物，因此被廣泛用到合成生物學(xué)領(lǐng)域，進(jìn)行一些活體功能材料的合成［14?15］。Timothy 等［16］設(shè)計(jì)了一系列基因電路，實(shí)現(xiàn)了大腸桿菌生物膜中CsgA蛋白纖維的結(jié)構(gòu)和功能的調(diào)節(jié)。Neel等［17］將一種人類細(xì)胞因子TFF2與大腸桿菌生物膜中的卷曲蛋白CsgA融合表達(dá)，體外成膠后，通過鑄模將大腸桿菌生物膜做成了一種可降解生物塑料。Zhong等［18］則是用枯草芽孢桿菌表達(dá)了一系列基于生物膜卷曲蛋白TasA的融合蛋白，將生物膜改造成了活體功能材料合成平臺；因?yàn)榧?xì)菌保持活性，該平臺表現(xiàn)出自我修復(fù)的能力；而生物膜適中的黏彈性則使其具有可3D打印的性質(zhì)。

生物膜雖然已經(jīng)被成功用于活體功能材料的合成，但是生物膜是粘彈性物質(zhì)［19］，機(jī)械性能較差，嚴(yán)重地限制了其在可穿戴設(shè)備、建筑材料等方面的應(yīng)用。因此，增強(qiáng)生物膜自身機(jī)械性能是拓寬其應(yīng)用面的關(guān)鍵。

本工作選用生物安全性良好的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）作為模式生物，進(jìn)行了TasA-n16N融合蛋白的表達(dá)，其中n16N為促進(jìn)碳酸鈣礦化的蛋白［20?21］，通過傳統(tǒng)碳酸銨分解通入二氧化碳進(jìn)行碳酸鈣礦化的方法，將表達(dá)TasA-n16N 的生物膜制成形狀規(guī)則的凝膠。借助同步輻射光源X射線透射顯微鏡等儀器表征生物膜的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，并通過流變測試對比了表達(dá)TasA-n16N的生物膜經(jīng)初步礦化形成凝膠前后的機(jī)械性能。本研究的結(jié)果為通過仿生礦化提高生物膜機(jī)械性能提供了新思路。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 主要儀器

Millipore Elix 5 型超純水儀，美國Millipore 公司；高速離心機(jī)（5418），德國Eppendorf公司；TOMY SX-700 型高溫高壓滅菌鍋，日本TOMY 公司；SHELLAB LI5-2 型恒溫培養(yǎng)箱，美國SHELLAB 公司；LEO 1530VP 掃描電子顯微鏡，德國LEO 公司；Tecnai G2 F20 S-TWIN 場發(fā)射透射電子顯微鏡，美國FEI公司；HYL-C小型組合式搖床，中國江蘇省太倉市強(qiáng)文實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；MCR301流變儀，奧地利Anton Paar公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

LB（Luria-Bertani）營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基粉末，去離子水，氯霉素，瓊脂粉，3-（N-嗎啉基）丙磺酸鈉，丙三醇，L-谷氨酸鈉，KH2PO4，K2HPO4，L-色氨酸，L-苯丙氨酸，鹽酸硫胺，MgCl2·6H2O，CaCl2，F(xiàn)eCl3·6H2O，MnCl2，ZnCl2，酵母提取物，酪蛋白質(zhì)氨基酸，葡萄糖，（NH4）2SO4，檸 檬 酸 鈉，MgSO4·7H2O，CaCl2·2H2O，異丙基-β-D-硫代半乳糖苷，（NH4）2CO3。

1.3 質(zhì)粒

TasA-n16N，質(zhì)粒載體：pHT01，在枯草芽孢桿菌中表現(xiàn)出氯霉素抗性。酶切位點(diǎn)：5'XbaI，3'SmaI。TasA和n16N兩種蛋白的氨基酸序列見表1。

表1 TasA和n16N兩種蛋白的基因序列Table 1 Gene sequence of TasA and n16N

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 溶液配制

2.1.1 培養(yǎng)基制備

LB抗性液體培養(yǎng)基：稱取5 g LB營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基粉末，用200 mL 去離子水溶解，120 ℃高溫滅菌20 min，冷卻至室溫，加入氯霉素，使其終濃度為10 μg?mL?1，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

LB抗性固體培養(yǎng)基：3 g瓊脂粉加入200 mL LB液體培養(yǎng)基（未加抗生素）內(nèi)，120 ℃高溫滅菌20 min，冷卻至50 ℃，加入氯霉素，使其終濃度為10 μg?mL?1，倒入細(xì)菌培養(yǎng)皿，冷卻凝固，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

MSgg 抗性液體培養(yǎng)基（1 L）：23.125 g 3-（N-嗎啉基）丙磺酸鈉，5 mL 丙三醇，5 g L-谷氨酸鈉，0.422 g KH2PO4，0.311 g K2HPO4，1 L去離子水溶液，pH調(diào)至7.2，120 ℃高溫滅菌20 min，冷卻至室溫，加入1 mL氨基酸1 000×母液（0.5 g L-色氨酸，0.5 g L-苯丙氨酸，100 mL 去離子水溶解），1 mL 金屬離子1 000×母液（40.66 g MgCl2·6H2O，7.768 6 g CaCl2，1.351 5 g FeCl3·6H2O，0.629 2 g MnCl2，0.013 6 g ZnCl2），100 μL 鹽酸硫胺10 000×母液（0.674 5 g 鹽酸硫胺，10 mL去離子水），最后加入氯霉素，使其終濃度為10 μg?mL?1，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

MSgg 抗性固體誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基：3 g 瓊脂粉加入200 mL MSgg 液體培養(yǎng)基（未加母液），120 ℃高溫滅菌20 min，冷卻至50 ℃，加入3 種母液及氯霉素，使其終濃度為10 μg?mL?1，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷，使其終濃度為1 mmol?L?1，倒入細(xì)菌培養(yǎng)皿，冷卻凝固，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化液制備

10×medium A base（100 mL）：1 g 酵母提取物，0.2 g酪蛋白質(zhì)氨基酸，90 mL去離子水溶液，120 ℃高溫滅菌20 min，加入10 mL 過濾除菌的50%葡萄糖，冷卻后4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

10× medium B base（100 mL）：2 g（NH4）2SO4，13.97 g K2HPO4，6 g KH2PO4，1 g 檸檬酸鈉，0.2 g MgSO4·7H2O，120 ℃高溫滅菌20 min，冷卻后4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

Medium A：4.05 mL 去 離 子 水，500 μL 10×medium A base，450 μL 10× medium B base，現(xiàn)配現(xiàn)用。

Medium B：4.95 mL Medium A，50 μL 金屬離子溶液（50 mmol·L?1CaCl2·2H2O，250 mmol·L?1MgCl2·6H2O），現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.2 生物膜培養(yǎng)

2.2.1 基因工程枯草芽孢桿菌制備

1）吸取2.5 μL野生型枯草芽孢桿菌30%甘油菌液，加入2 mL LB 無抗液體培養(yǎng)基中，37 ℃，220 r?min?1過夜培養(yǎng)；

2）取上述菌液50 μL 于5 mL Medium A 中，37 ℃，220 r?min?1培養(yǎng)4 h；

3）接500 μL A 菌 液 于5 mL Medium B 中，37 ℃，220 r?min?1培養(yǎng)1.5 h，得到野生型枯草芽孢桿菌感受態(tài)細(xì)胞；

4）500 μL 感受態(tài)細(xì)胞中加入不超過3 μg 含TasA-n16N 片段的質(zhì)粒，且質(zhì)粒體積不超過感受態(tài)細(xì)胞懸液的1/20，37 ℃靜置1 h；

5）37 ℃，220 r?min?1培養(yǎng)2 h，去200 μL 菌液均勻涂于抗性LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h；

6）挑取固體培養(yǎng)基上的單菌落于2 mL LB抗性液體培養(yǎng)基中，37 ℃，220 r?min?1過夜培養(yǎng)，500 μL菌液加入500 μL 60%甘油溶液中，得到含有TasAn16N 質(zhì)粒的工程枯草芽孢桿菌30% 甘油菌液，?80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 TasA-n16N生物膜培養(yǎng)

1）接5 μL TasA-n16N枯草芽孢桿菌30%甘油菌液于20 mL LB 抗性液體培養(yǎng)基中，37 ℃，220 r?min?1過夜培養(yǎng)；

2）過夜培養(yǎng)的菌液5 kg離心10 min，去除上清，MSgg抗性液體培養(yǎng)基重懸；

3）將重懸液滴在MSgg抗性固體誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基上（每滴15 μL），在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d得到固相培養(yǎng)的生物膜。

2.3 塊狀生物膜凝膠制備及表征

1）將生物膜從固體培養(yǎng)基上刮下，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，此時(shí)保存平行樣品備用，其他樣品加入CaCl2溶液，攪拌混勻形成勻漿；

2）將（NH4）2CO3粉末置于培養(yǎng)皿中，用封口膜封住，在封口膜上戳7個(gè)針孔；

3）將裝有生物膜勻漿的培養(yǎng)皿與（NH4）2CO3培養(yǎng)皿放入大培養(yǎng)皿中，封口膜密封，20 ℃靜置7 d；

4）取樣，分別制樣，用透射電子顯微鏡、掃描電子顯微鏡、同步輻射光源X 射線透射顯微鏡表征其內(nèi)部結(jié)構(gòu)；

5）將收集的生物膜樣品與最后得到的凝膠樣品進(jìn)行流變學(xué)測試，對比其機(jī)械性能；

6）將形成塊狀生物膜凝膠轉(zhuǎn)移至MSgg抗性固體誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基上，30 ℃恒溫培養(yǎng)72 h；在塊狀凝膠上取樣接種于LB 抗性液體培養(yǎng)基，37 ℃，220 r?min?1過夜培養(yǎng)。

3 結(jié)果與討論

3.1 生物膜及塊狀凝膠的形貌結(jié)構(gòu)

在MSgg 抗性固體誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d后，Bacillus subtilis形成肉眼可見的形貌區(qū)別于普通單菌落的薄膜狀結(jié)構(gòu)，即生物膜；其面積比最初滴在培養(yǎng)基上的液滴面積稍有擴(kuò)張（圖1（a））。在轉(zhuǎn)移收集過程中，固相培養(yǎng)的生物膜黏稠含水，粘附在培養(yǎng)皿底部（圖1（b））。收集的生物膜與CaCl2溶液充分混合形成的勻漿（圖1（c））在經(jīng)過7 d的礦化后，形成了圓形塊狀凝膠（Block gel）（圖1（d）），掃描電子顯微鏡（Scanning Electron Microscopy，SEM）觀察塊狀凝膠截面，看到其內(nèi)部含有大量細(xì)菌（圖1（e）），透射電子顯微鏡（Transmission Electron Microscopy，TEM）（圖1（f））和同步輻射光源X 射線透射顯微鏡（圖1（g））觀察到單個(gè)細(xì)菌形貌完整，周圍還有TasA蛋白質(zhì)組裝形成的纖維結(jié)構(gòu)，說明融合n16N蛋白質(zhì)后，TasA蛋白質(zhì)的功能未受到影響。

圖1 固相培養(yǎng)生物膜及塊狀凝膠的表征(a)固相培養(yǎng)生物膜，(b)收集到皿里的生物膜，(c)生物膜CaCl2溶液形成的勻漿，(d)圓形塊狀凝膠block gel，(e~g)塊狀凝膠的SEM、TEM、同步輻射X射線透射顯微成像Fig.1 Characterization of solid-phase cultured biofilm and block gel(a)Solid-phase cultured biofilm,(b)Biofilm collected in a dish,(c)Homogenates formed from biofilm CaCl2 solutions,(d)Block gel,images of(e)SEM,(f)TEM,(g)Synchrotron X-ray transmission microscope of block gel

3.2 生物膜及塊狀凝膠的機(jī)械性能

流變學(xué)測試結(jié)果顯示，固相培養(yǎng)的生物膜的流變學(xué)性質(zhì)與傳統(tǒng)水凝膠性質(zhì)類似，即其儲(chǔ)存模量（G'）大于損耗模量（G''）；在應(yīng)變破壞其結(jié)構(gòu)后，G'下降，G''增大，并出現(xiàn)重合。塊狀凝膠的G'略有增大，說明機(jī)械性能增強(qiáng)。塊狀凝膠在5%應(yīng)變下的頻率掃描結(jié)果顯示其G'小于G''，說明生物膜形成塊狀后結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，不再是傳統(tǒng)水凝膠結(jié)構(gòu)，而在掃描過程中出現(xiàn)了下降再上升的現(xiàn)象（圖2（a））。為了排除偶然性，我們在1%和0.1%的應(yīng)變下進(jìn)行頻率掃描，得到一致的結(jié)果（圖2（b）），說明其結(jié)構(gòu)在掃描過程中經(jīng)歷了被破壞再恢復(fù)的過程。在1 Hz 固定頻率下的應(yīng)變掃描結(jié)果顯示，塊狀凝膠的兩種模量都隨著應(yīng)變增強(qiáng)而下降，即其具有應(yīng)變稀化性質(zhì)。在應(yīng)變小于1%時(shí)，其性質(zhì)與生物膜性質(zhì)類似，G'大于G''，應(yīng)變超過1%時(shí)，G'小于G''，即結(jié)構(gòu)性質(zhì)發(fā)生變化，這個(gè)結(jié)果與頻率掃描結(jié)果一致（圖2（c））。綜上所述，生物膜在形成塊狀凝膠后，結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，且機(jī)械性能提高。

圖2 流變學(xué)性質(zhì)測試(a)5%應(yīng)變頻率掃描，(b)1 Hz 應(yīng)變掃描，(c)三種強(qiáng)度應(yīng)變頻率掃碼Fig.2 Rheological test(a)Frequency sweep at 5%strain,(b)Strain sweep at 1 Hz,(c)Frequency sweep at three strains

3.3 塊狀凝膠內(nèi)部細(xì)菌活性測試

細(xì)菌活體性質(zhì)是活體功能材料與傳統(tǒng)生物材料的最大不同。因此，在提高生物膜機(jī)械性能的同時(shí)，我們測試了其內(nèi)部細(xì)菌的活性。圖3（a）顯示，形成的塊狀生物膜凝膠轉(zhuǎn)移至MSgg抗性固體誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d 后，周圍長出了新的褶皺，這說明生物膜經(jīng)歷結(jié)構(gòu)破壞再重組后形成塊狀凝膠，在缺乏營養(yǎng)物質(zhì)的過程中依然保持了再生功能。此外，塊狀凝膠內(nèi)的細(xì)菌在LB 抗性液體培養(yǎng)基里過夜培養(yǎng)后，澄清的培養(yǎng)基出現(xiàn)了肉眼可見的渾濁（圖3（b）），再次證明凝膠內(nèi)細(xì)菌仍有活性。這些結(jié)果說明生物膜對于其內(nèi)部細(xì)菌有很強(qiáng)的保護(hù)作用，為其被改造為活體功能材料提供了保障。

圖3 塊狀生物膜內(nèi)部細(xì)菌活性測試(a)塊狀生物膜周圍長出褶皺狀被膜，(b)塊狀生物膜內(nèi)部細(xì)菌的活力Fig.3 The activity test of bacteria inside block biofilm(a)Formation of a wrinkled envelope around the block gel,(b)The growth of bacteria inside the block gel

4 結(jié)語

本研究中，我們選取枯草芽孢桿菌生物膜為模式生物，結(jié)合蛋白融合技術(shù)和傳統(tǒng)碳酸鈣礦化方法，研究了TasA-n16N融合蛋白的表達(dá)對該生物膜機(jī)械性能的影響。結(jié)果顯示：n16N增強(qiáng)了生物膜對Ca2+的吸收，從而提高了生物膜的機(jī)械性能，卻不影響生物膜的生物活性。這說明活體生物膜與無機(jī)礦物結(jié)合的仿生礦化可以有效調(diào)控生物膜的機(jī)械性能。而且，不同礦化層的性質(zhì)不同，如碳酸鈣硬度較高，磷酸鈣的骨相容性較好，這為生物膜活體材料在建筑、骨修復(fù)和污水處理等領(lǐng)域提供了廣闊的應(yīng)用空間。

作者貢獻(xiàn)聲明秦思民：設(shè)計(jì)和完成所有實(shí)驗(yàn)，并分析數(shù)據(jù)和撰寫文章；劉蘇瑩：提供TasA基因序列；諸穎：討論和分析數(shù)據(jù)；呂敏：分析數(shù)據(jù)并撰寫文章。