王曉明 陳孟毅 吳福海 溫 凱 趙海龍 周佳駿 李洪玉

（原子高科股份有限公司 北京 102413）

64Cu 核素具有適宜的正電子能量（0.653 MeV）和半衰期（12.7 h），可以對多肽、小分子、抗體等進行標記制備正電子發(fā)射計算機斷層顯像（Positron Emission Computed Tomography，PET）藥物，或作為診療一體化的配對核素，進行神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、前列腺癌等疾病的診斷及治療［1?7］。在藥物標記過程中64Cu 核素主要以氯化銅［64Cu］溶液為原料載體，目前已實現(xiàn)國產(chǎn)化批量生產(chǎn)［8?9］，可滿足國內(nèi)科研醫(yī)療機構(gòu)的研究應(yīng)用。氯化銅［64Cu］溶液作為一種藥用原料，其質(zhì)量控制對藥品的安全性、有效性具有重要意義，而放射化學純度是放射性藥品及核素前體質(zhì)量標準的一個關(guān)鍵項目，開發(fā)滿足藥品檢驗技術(shù)要求的分析方法是非常必要的。

放射化學純度測量方法主要為色譜法，包括薄層色譜法（Thin-layer Chromatography，TLC）及高效液 相 色 譜 法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）。其中TLC 法在放射性藥品生產(chǎn)檢驗中應(yīng)用最為廣泛，具有快速檢驗和操作簡便等優(yōu)點；HPLC雖然在檢測準確度、精密度方面更具優(yōu)勢，但由于放射性藥物通常有效期較短，而HPLC 分析所需時間較長，需配備相應(yīng)檢測設(shè)備及對操作人員要求較高，因此使HPLC 在實際應(yīng)用中存在一定局限性。與氯化銅［64Cu］溶液類似的氯化鎵［68Ga］溶液和氯化镥［177Lu］溶液，歐洲藥典收錄的放射化學純度的檢測方法均為TLC 法［10?11］，該方法通 過 增 加 對 二 乙 烯 三 胺 五 乙 酸（Diethylenetriaminepentaacetic Acid，DTPA）絡(luò)合離子為參比樣品的測試，實現(xiàn)放射性金屬離子與其絡(luò)合物在測試條件下的分離，并且分離度滿足系統(tǒng)適用性的要求，以此確認方法對待測放射性金屬離子檢出的有效性。

目前，各國藥典均未收錄氯化銅［64Cu］溶液的質(zhì)量標準，文獻中對氯化銅［64Cu］溶液的質(zhì)量研究亦少見報道。其放射化學純度的TLC 法主要以0.1 mol?L?1檸檬酸鈉或乙酸乙酯［12?14］為展開劑，缺少對系統(tǒng)適用性的考察。本文在前期研究的基礎(chǔ)上［15］，通過對多種常用固定相和流動相條件的篩選，以及對參比樣品配制條件的摸索，確定了滿足系統(tǒng)適用性的氯化銅［64Cu］溶液放射化學純度的TLC測試方法。

1 試驗部分

1.1 主要儀器

AR-2000型放射性薄層掃描儀：美國BIOSCAN公司。

1.2 主要材料與試劑

甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷、鹽酸、二乙烯三胺五乙酸，均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；iTLC-SG 玻璃微纖維硅膠色譜紙，美國Agilent Technologies公司；Whatman No.1色譜紙，美國Whatman 公司；鋁基硅膠板，美國Merck 公司；聚酰胺制薄膜，浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 放射化學純度分析方法的建立

樣品制備：取適量氯化銅［64Cu］溶液（0.001~0.010 mol?L?1HCl 體系），以氯化銅［64Cu］溶液體系相同濃度的HCl 溶液稀釋至放射性濃度約為37 MBq?mL?1，為供試品溶液；取供試品溶液，按一定比例加入DTPA 的NaOH 溶液，混合均勻，為參比溶液。

操作方法：在固定相一端1.5 cm處點樣，晾干后置于盛有展開劑的展開缸中，保持點樣點處于展開劑液面之上，使樣品按上行色譜法進行分離，展開劑展開約10 cm 后取出固定相，懸掛晾干后以放射性薄層掃描儀測量放射性譜峰計數(shù)，計算放射化學純度和Rf值，根據(jù)譜峰峰型、Rf值、參比主峰與供試品主峰分離度情況，篩選合適的測試條件。

測試條件篩選實驗：

1）固定相及流動相篩選，在9 g?L?1NaCl 溶液（pH 2.30±0.05）、不同比例甲醇-77 g?L?1乙酸銨、不同比例的乙腈-水、不同比例丙酮-水、乙酸乙酯、二氯甲烷-乙腈-甲醇-水相混合體系等展開劑條件下，并以鹽酸調(diào)節(jié)流動相pH，考察供試品及參比溶液在不同固定相的展開情況。

2）展開劑組分比例優(yōu)化，以二氯甲烷、乙腈、甲醇、不同濃度HCl溶劑配制展開劑，比較各組分不同比例、不同鹽酸濃度的展開劑對供試品及參比溶液的測試結(jié)果，供試品主峰應(yīng)具有良好峰型，與參比主峰的分離度大于1.0。

3）參比溶液參數(shù)優(yōu)化，配制10 g?L?1DTPA（4 g?L?1NaOH）、20 g?L?1DTPA（11 g?L?1NaOH）和4 g?L?1NaOH溶液，與供試品溶液按不同比例混合，測試此條件的參比溶液，考察參比溶液中生成的64Cu-DTPA絡(luò)合物主峰峰型及Rf值。

方法應(yīng)確保供試品的放射化學純度不小于95%的限度標準，系統(tǒng)適用性要求供試品與參比主峰分離度R大于1.0，并具有良好的放射性譜峰峰型。分離度的計算公式為：

式中：d2為相鄰兩峰中后一峰與原點的距離，mm；d1為相鄰兩峰中前一峰與原點的距離，mm；W1和W2為相鄰兩峰各自的峰寬，mm。

1.3.2 樣品檢驗

進行三批次氯化銅［64Cu］溶液的放射化學純度測試，確認分析方法適用于常規(guī)產(chǎn)品的質(zhì)量檢驗。

2 結(jié)果與討論

2.1 放射化學純度分析方法的建立

1）固定相與展開劑的初步篩選：本階段實驗以篩選條件為目的，主要關(guān)注譜峰峰型及分離度。表1 列出了具有代表性的測試條件及結(jié)果，其中Rf小于0.1，代表譜峰處于點樣原點范圍，大于0.9，代表譜峰處于溶劑展開頂端。在實驗的展開劑中，Whatman No.1 色譜紙相比iTLC-SG 硅膠色譜紙主要存在展開時間長、不易晾干等問題，且未獲得相對較優(yōu)結(jié)果，因此后續(xù)條件篩選中固定相以iTLC-SG硅膠色譜紙為主。表1 中第4、5 兩個條件分別為歐洲藥典氯化镥［177Lu］溶液和氯化鎵［68Ga］溶液放射化學純度分析方法，實驗在此基礎(chǔ)上進行了變更固定相及流動相比例等條件實驗，但存在供試品與參比主峰無法分離、雙峰或多峰、拖尾等現(xiàn)象。以丙酮、丙酮-水（pH 2.0）、乙酸乙酯為展開劑，主要存在雙峰、拖尾及展開時間較長等問題；以乙腈-水（pH 1.0）為展開劑時，供試品與參比主峰位置大致相同，說明展開劑極性偏大，無法實現(xiàn)Cu2+離子與Cu-DTPA絡(luò)合物的分離；替換極性較大的水組分，以二氯甲烷-乙腈為展開劑，供試品與參比主峰峰型較好，但兩峰的Rf值相近，未能實現(xiàn)分離。在此基礎(chǔ)上加入甲醇，并以0.01 moL?L?1HCl 溶液調(diào)節(jié)展開劑酸度，獲得了完全分離的、峰型良好的供試品與參比溶液譜峰，完成了測試條件的篩選，譜圖如圖1 所示。初步確定方法以iTLC-SG 硅膠色譜紙為固定相，以體積比40:50:9.5:0.5 的二氯甲烷-乙腈-甲醇-0.01 mol?L?1HCl混合溶液為展開劑，約15 min即可完成樣品的測試。實驗還嘗試了鋁基硅膠板、聚酰胺薄膜為固定相，樣品展開時間大于30 min，因此未在此條件下進行后續(xù)條件試驗。

表1 不同固定相和展開劑條件下的放射化學純度測試結(jié)果Table 1 The radiochemical purity test results of different stationary phases and mobile phases

圖1 氯化銅[64Cu]溶液供試品(a)及參比溶液(b)放射化學純度譜圖Fig.1 The radiochemical purity spectrum of copper[64Cu]chloride test solution(a)and reference solution(b)

2）展開劑組分比例優(yōu)化：實驗先通過固定展開劑中鹽酸濃度，對展開劑中各組分的比例進行優(yōu)化實驗，測試了供試品和參比溶液，結(jié)果如表2 所示。由第4、5和6三個條件結(jié)果可見，展開劑中加入適量鹽酸溶液調(diào)節(jié)酸度，對供試品形成具有良好峰型的單一主峰起到關(guān)鍵作用，其原因可能為通過提高展開劑酸度，抑制微量銅離子在近似中性展開條件下形成氫氧化銅膠體；當二氯甲烷比例過高或過低，對應(yīng)乙腈比例過低或過高時，供試品存在輕微拖尾現(xiàn)象，導(dǎo)致放射化學純度檢測結(jié)果偏低，參比主峰峰型同樣受到影響。因此選擇第7號的條件為展開劑有機組分配比，即二氯甲烷、乙腈、甲醇體積比40:50:9.5。

表2 展開劑組成對放射化學純度測試結(jié)果的影響Table 2 The effect of mobile phases composition on radiochemical purity

在確定流動相中有機相組成比例的基礎(chǔ)上，又對鹽酸溶液濃度進行了條件優(yōu)化實驗，結(jié)果見表3所 示。實 驗 選 取0.01 mol ?L?1、0.05 mol ?L?1、0.1 mol?L?1三個鹽酸濃度進行供試品和參比溶液的測試。當鹽酸濃度較高時，供試品可以獲得較好的放射化學純度測試結(jié)果，但參比主峰出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象；當流動相中鹽酸溶液濃度適當降低，供試品與參比溶液主峰均可獲得較好的峰型，供試品溶液放射化學純度可達98%以上，與圖1中供試品譜圖相比，點樣端小峰明顯變小，由此進一步證明供試品點樣端小峰為氫氧化銅膠體峰；而銅離子與DTPA 在偏堿性條件下更易絡(luò)合，因此展開劑酸度過高時參比主峰出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。綜合以上因素，本實驗選取0.05 mol?L?1HCl溶液配制展開劑。

表3 展開劑中鹽酸濃度對放射化學純度測試結(jié)果的影響Table 3 The effect of hydrochloric acid concentration on radiochemical purity

3）參比溶液參數(shù)優(yōu)化：本研究以兩種濃度的DTPA 溶液與供試品按不同比例配制為參比溶液，進行參比溶液參數(shù)的優(yōu)化，并以NaOH 溶液與供試品的混合溶液考察了酸堿條件對系統(tǒng)適用性的影響，結(jié)果見表4 所示。當NaOH 溶液與供試品體積比為1:1 時，測試結(jié)果仍為供試品主峰；NaOH 溶液相對過量時，混合溶液偏堿性，出現(xiàn)雙峰，且有明顯拖尾現(xiàn)象，為溶液中生成氫氧化銅沉淀，使點樣端形成放射性譜峰。10 g?L?1DTPA 溶液與供試品等體積或過量一倍混合為參比溶液時，形成峰型較好的單一或獨立雙峰；20 g?L?1DTPA溶液與等量或過量供試品混合為參比溶液時，均可得到較好峰型的參比主峰，以上條件的參比溶液均可滿足系統(tǒng)適用性要求。因此本研究中以常用的10 g?L?1DTPA 溶液與等體積的供試品混合配制參比溶液。

表4 參比溶液參數(shù)優(yōu)化Table 4 Parameter optimization of reference solution

通過上述條件篩選及優(yōu)化實驗，確定了氯化銅［64Cu］溶液放射化學純度分析方法為：以iTLC-SG色譜紙為固定相，二氯甲烷、乙腈、甲醇、0.05 mol?L?1HCl溶液按體積比40:50:9.5:0.5配制的混合溶液為流動相，以10 g?L?1DTPA溶液與等體積的供試品混合配制為參比溶液。此條件下，氯化銅［64Cu］溶液供試品主峰的Rf值大于0.9，具有良好峰型；參比主峰Rf值小于0.1，供試品與參比主峰的分離度R大于1.0，滿足系統(tǒng)適用性要求，完成分析方法的建立。

2.2 樣品檢驗

用建立的分析方法對氯化銅［64Cu］溶液連續(xù)三批次的生產(chǎn)工藝驗證樣品進行檢驗，放射化學純度為96.6%~99.3%，檢驗結(jié)果符合限度要求，證明本方法可用于產(chǎn)品的日常檢驗。

3 結(jié)語

本研究建立了一種快速、簡便的氯化銅［64Cu］溶液放射化學純度TLC分析方法。方法以iTLC-SG色譜紙為固定相，二氯甲烷、乙腈、甲醇、0.05 mol?L?1HCl溶液按體積比40:50:9.5:0.5配制的混合溶液為流動相進行供試品和參比溶液分析。經(jīng)多批次樣品檢驗，證明方法適用于日常產(chǎn)品檢驗。參比溶液的放射性主峰與供試品主峰分離度大于1.0，滿足系統(tǒng)適用性要求，達到歐洲藥典中同類型醫(yī)用放射性核素溶液檢驗方法的技術(shù)要求，為確保藥物標記研究中對64Cu核素原料的質(zhì)量控制提供了保證。

作者貢獻聲明王曉明為方法開發(fā)建立主要完成人；陳孟毅、吳福海、周佳駿參與具體條件優(yōu)化實驗；溫凱、趙海龍?zhí)峁┞然~[64Cu]溶液樣品；李洪玉為項目負責人，提供實驗方案指導(dǎo)意見。