熊濤 王慧 黃夢婷 陳錚銳

膀胱癌是與泌尿生殖道癌癥相關(guān)死亡的主要原因，也是男性治療中最昂貴的惡性腫瘤[1]。外科手術(shù)、放射療法和化學療法是膀胱癌患者的主要治療方法[2]。然而，這些推薦療法的治療效果仍然有限，并且在過去的幾十年中，膀胱癌患者的5年總生存率一直處于較低水平，死亡率并未發(fā)生明顯變化[3]。因此，迫切需要早期診斷標記和新的治療策略來治療膀胱癌。毛萼乙素(Eriocalyxin)是從傳統(tǒng)中草藥毛萼香茶菜(Isodon eriocalyx)提取的對映體-月桂烯二萜類化合物，具有多種功能，如抗癌和抗炎[4]。研究表明，毛萼乙素可抑制宮頸癌細胞C-33A的增殖[5]，降低乳腺癌細胞的生存能力，誘導(dǎo)細胞凋亡[6]。毛萼乙素可通過升高促凋亡蛋白Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 Associated X Protein，Bax)的表達，促進肝癌細胞HepG2的凋亡，從而抑制其增殖[7]。長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)氨甲酰磷酸合成酶1-內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄本1(carbamoyl-phosphate synthase 1 intronic transcript 1，CPS1-IT1)在上皮性卵巢癌組織和細胞中下調(diào)表達，過表達lncRNA CPS1-IT1可促進卵巢癌細胞的增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡[8]。lncRNA CPS1-IT1在肺癌組織中低表達，過表達lncRNA CPS1-IT1抑制肺癌細胞的增殖和侵襲[9]。lncRNA CPS1-IT1在結(jié)直腸癌組織和細胞中下調(diào)表達，可抑制結(jié)直腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲，促進細胞凋亡[10]。但毛萼乙素和lncRNA CPS1-IT1對膀胱癌T24細胞增殖、遷移和侵襲的影響，且毛萼乙素是否通過調(diào)控lncRNA CPS1-IT1的表達影響膀胱癌T24細胞的增殖、遷移和侵襲能力，目前仍然未知。本研究探討毛萼乙素在膀胱癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移行為中的作用，并結(jié)合lncRNA CPS1-IT1評估其在膀胱癌中的生物學調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1 材料 膀胱癌細胞株T24(美國典型培養(yǎng)物保藏中心ATCC)，毛萼乙素、二甲基亞砜(Dimethyl sulphoxide，DMSO)(上海源葉生物)，lncRNA DNA-CPS1-IT1過表達質(zhì)粒pcDNA-CPS1-IT1、空載質(zhì)粒pcDNA、LipofectamineTM2000(美國Invitrogen)，針對lncRNA DNA-CPS1-IT1小干擾RNA si-CPS1-IT1、其陰性對照si-NC、Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM培養(yǎng)基)、TRIzol試劑(美國Thermo Fisher Scientific)，PrimeScript RT、SYBR Premix ExTaq II試劑盒(北京Takara)，四甲基偶氮唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)(上海Bio Basic)，硝酸纖維素膜(英國Amersham Bioscience)，ECL檢測試劑(美國Millipore)。

1.2 細胞培養(yǎng)與處理 T24細胞在含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在5% CO2濕潤的環(huán)境中于37℃孵育。在對數(shù)生長期的T24細胞中加入2.5 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L濃度的毛萼乙素[7]，分別記為ERB-L組、ERB-M組、ERB-H組。同時設(shè)立未給藥的T24細胞為對照(Con組)。配制不同濃度的毛萼乙素時，以少量的DMSO助溶，以DMEM培養(yǎng)基稀釋成2.5 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L的濃度備用。

1.3 細胞轉(zhuǎn)染與分組 在6孔板中培養(yǎng)T24細胞(1×106個/孔)以達到80%融合度，然后使用LipofectamineTM2000試劑用pcDNA、pcDNA-CPS1-IT1、si-NC、si-CPS1-IT1轉(zhuǎn)染T24細胞，根據(jù)具體的說明進行操作。轉(zhuǎn)染孵育24 h后，通過qRT-PCR分析轉(zhuǎn)染效率，然后用于進一步的測定。其中，轉(zhuǎn)染si-NC和si-CPS1-IT1的T24細胞加入10 μmol/L毛萼乙素作用24 h。轉(zhuǎn)染后的T24細胞分別記為pcDNA組、pcDNA-CPS1-IT1組、ERB+si-NC組、ERB+si-CPS1-IT1組。

1.4 細胞增殖測定 使用MTT測定法測定T24細胞增殖抑制率。在96孔板中培養(yǎng)T24細胞，每孔約5×103個細胞，T24細胞粘附在培養(yǎng)皿壁上，根據(jù)1.2和1.3方法進行毛萼乙素或轉(zhuǎn)染處理。孵育48 h后，在每個孔中將10 μl MTT(5 μg/ml)與培養(yǎng)基混合，再培養(yǎng)4 h形成甲瓚結(jié)晶，并再次溶于100 μl DMSO中。最后，使用BioTek自動酶標儀在490 nm處測量吸光度OD值，計算抑制率(%)。

1.5 免疫印跡法(Western blot) 將不同分組的T24細胞在200 μl RIPA裂解液中裂解，裂解液中含有蛋白酶抑制劑。然后，用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，脫脂奶封閉后，將膜與抗細胞核相關(guān)抗原Ki-67(nuclear associated antigen Ki67，Ki-67)，基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteases，MMP)-2，MMP-9和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)的一抗(均為1∶1 000稀釋)孵育過夜。與二抗(為1∶2 000稀釋)孵育后，化學發(fā)光信號使用ECL檢測試劑可視化，GAPDH用作對照，ImageJ軟件分析Ki-67、MMP-2和MMP-9蛋白表達。

1.6 細胞遷移、侵襲檢測 通過Transwell測定法確定不同分組的T24細胞遷移和侵襲。在Transwell底部腔室中裝入600 μl含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。將T24細胞重懸于不含胎牛血清的培養(yǎng)基中，并將100 μl T24細胞(1×104)置于上腔室中。溫育24 h后，將細胞用PBS洗滌3次，并用甲醇固定10 min，然后用結(jié)晶紫染色5 min。 通過計數(shù)穿過過濾器向腔室下表面遷移的細胞來量化細胞遷移。在顯微鏡下計算5個隨機視野的平均值為遷移細胞數(shù)。為進行侵襲測定，將腔室的上表面在37℃的培養(yǎng)箱中用Matrigel預(yù)處理6 h。之后的步驟同遷移測定。

1.7 RNA分離和qRT-PCR 使用TRIzol試劑從膀胱癌T24細胞(2×106個)中提取總RNA。按照說明，使用帶有g(shù)DNA Eraser的PrimeScript RT試劑盒，將每個RNA(1 μg)逆轉(zhuǎn)錄為互補DNA(cDNA)。之后，在ABI 7900實時PCR系統(tǒng)上使用SYBR Premix ExTaq II試劑盒進行PCR，以定量lncRNA CPS1-IT1的相對表達。GAPDH用作內(nèi)部對照。2-ΔΔCt方法分析數(shù)據(jù)并計算lncRNA CPS1-IT1的相對表達。引物序列為lncRNA CPS1-IT1 正向5’-CAC AGA TGA TCC ACGCGCGTT-3’和反向5’-GCG TGC ATC AAT GAC ACT TCA-3’；GAPDH 正向5’-CGG AGT CAA CGG ATT TGG TCG TAT TGG-3’和反向5’-GCT CCT GGA AGA TGG TGA TGG GAT TTC C-3’。

2 結(jié)果

2.1 毛萼乙素對膀胱癌T24細胞增殖的影響 MTT和Western blot檢測結(jié)果顯示，2.5 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L濃度的毛萼乙素作用于膀胱癌T24細胞后，ERB-L組、ERB-M組、ERB-H組T24細胞的增殖抑制率均高于Con組，Ki-67蛋白表達量低于Con組(P<0.05)；與ERB-L組比較，ERB-M組、ERB-H組T24細胞的增殖抑制率升高，Ki-67蛋白的表達量降低；ERB-H組較ERB-M組提高T24細胞的增殖抑制率，降低Ki-67蛋白的表達量，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1，表1。

圖1 Ki-67蛋白表達

表1 毛萼乙素對膀胱癌T24細胞增殖的影響

2.2 毛萼乙素對膀胱癌T24細胞遷移、侵襲的影響 Transwell和Western blot檢測結(jié)果顯示，2.5 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L濃度的毛萼乙素作用于膀胱癌T24細胞后，ERB-L組、ERB-M組、ERB-H組T24細胞的遷移、侵襲細胞數(shù)、MMP-2、MMP-9蛋白的表達量均低于Con組(P<0.05)；與ERB-L組比較，ERB-M組、ERB-H組T24細胞的遷移、侵襲細胞數(shù)、MMP-2、MMP-9蛋白的表達量減少(P<0.05)；ERB-H組較ERB-M組降低T24細胞的遷移、侵襲細胞數(shù)、MMP-2、MMP-9蛋白的表達量(P<0.05)。見圖2，表2。

圖2 遷移侵襲相關(guān)蛋白表達

表2 毛萼乙素對膀胱癌T24細胞遷移、侵襲的影響

2.3 毛萼乙素對膀胱癌T24細胞中l(wèi)ncRNA CPS1-IT1表達的影響 qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，ERB-L組、ERB-M組、ERB-H組T24細胞中l(wèi)ncRNA CPS1-IT1表達量均高于Con組(P<0.05)；與ERB-L組比較，ERB-M組、ERB-H組T24細胞的lncRNA CPS1-IT1表達量增加(P<0.05)；ERB-H組較ERB-M組提高T24細胞內(nèi)lncRNA CPS1-IT1表達量，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 毛萼乙素對膀胱癌T24細胞中l(wèi)ncRNA CPS1-IT1表達的影響

2.4 lncRNA CPS1-IT1過表達對膀胱癌T24細胞增殖、遷移侵襲的影響 qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染pcDNA-CPS1-IT1后的效率，發(fā)現(xiàn)pcDNA-CPS1-IT1組T24細胞中l(wèi)ncRNA CPS1-IT1的表達量高于pcDNA組(P<0.05)，提示成功構(gòu)建lncRNA CPS1-IT1過表達的T24細胞。MTT、Transwell和Western blot檢測結(jié)果表明，pcDNA-CPS1-IT1組T24細胞的抑制率高于pcDNA組，遷移、侵襲細胞數(shù)、Ki-67、MMP-2和MMP-9蛋白表達量低于pcDNA組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4，圖3。

表4 lncRNA CPS1-IT1過表達對膀胱癌T24細胞增殖、遷移侵襲的影響

圖3 增殖、遷移侵襲相關(guān)蛋白表達

2.5 抑制lncRNA CPS1-IT1表達逆轉(zhuǎn)了毛萼乙素(10 μmol/L)對膀胱癌T24細胞增殖、遷移、侵襲的作用 qRT-PCR、MTT、Transwell和Western blot檢測顯示，與ERB+si-NC組比較，ERB+si-CPS1-IT1組T24細胞的CPS1-IT1表達量、抑制率降低，遷移、侵襲細胞數(shù)、Ki-67、MMP-2和MMP-9蛋白表達量升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖4，表5。

圖4 增殖、遷移侵襲相關(guān)蛋白表達

表5 抑制lncRNA CPS1-IT1表達逆轉(zhuǎn)了毛萼乙素對膀胱癌T24細胞增殖、遷移、侵襲的作用

3 討論

膀胱癌是常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率較高。吸煙是膀胱癌的最強危險因素，占所有病例的50%～65%[11]。盡管近年來全球膀胱癌死亡率有所降低，但膀胱癌患者容易發(fā)生癌癥轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移性膀胱癌的預(yù)后仍然很差[12]。目前，尚未闡明膀胱癌的發(fā)生和發(fā)展的分子機制。因此，描述膀胱癌發(fā)展中涉及的分子機制，以發(fā)現(xiàn)潛在的新穎和重要的診斷標志物和治療策略。

毛萼乙素具有許多藥理活性，包括抑制炎性反應(yīng)，調(diào)節(jié)免疫細胞分化，抑制腫瘤細胞增殖，引起細胞周期停滯，影響血管生成并促進癌細胞凋亡[4]。毛萼乙素已被證實可有效對抗多種癌癥，例如在前列腺癌PC-3和22RV1細胞中，毛萼乙素以時間和劑量依賴性的方式抑制細胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡和自噬，潛在機制與抑制蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)和雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的磷酸化有關(guān)[13]。毛萼乙素可增強吉西他濱對胰腺癌的細胞毒性和凋亡作用[14]。毛萼乙素通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子-κB p65，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄因子3(signal transducers and activators of transcription 3，STAT3)磷酸化來誘導(dǎo)三陰性乳腺癌MDA-MB231細胞凋亡[15]。但是，毛萼乙素的詳細作用及其在膀胱癌中涉及的機制尚不清楚。本研究顯示毛萼乙素對膀胱癌T24細胞增殖和轉(zhuǎn)移的抑制能力，即2.5 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L濃度的毛萼乙素顯著增加T24細胞的增殖抑制率，減少遷移、侵襲細胞數(shù)、Ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白的表達量，并呈一定的濃度依賴性，表現(xiàn)出一定的抗膀胱癌增殖和轉(zhuǎn)移活性。這些為進一步開展毛萼乙素體內(nèi)研究提供了依據(jù)，毛萼乙素也被證明是開發(fā)針對膀胱癌的新型療法的潛在候選藥物。

lncRNA代表一類新穎的非編碼RNA，其長度超過200個核苷酸，并且不具有蛋白質(zhì)編碼潛能。研究發(fā)現(xiàn)lncRNA失調(diào)，并參與多種癌癥生物學過程，例如增殖，凋亡，遷移和侵襲[16]。越來越多的lncRNA已被證明在癌癥的發(fā)生和發(fā)展中起癌基因或抑癌作用[17]。lncRNA CPS1-IT1最近被鑒定多種癌癥類型發(fā)展和進程的基因調(diào)節(jié)劑。研究顯示，與配對的正常腦組織和人星形膠質(zhì)細胞相比，神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織和細胞中的lncRNA CPS1-IT1水平分別降低；lncRNA CPS1-IT1表達的上調(diào)導(dǎo)致神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的增殖，遷移和侵襲能力下降[18]。Zhou等[19]觀察到lncRNA CPS1-IT1在人黑素瘤組織和細胞系中低表達，與轉(zhuǎn)移和腫瘤分期顯著相關(guān)。此外，還指出lncRNA CPS1-IT1的過度表達抑制黑素瘤細胞的細胞遷移、侵襲，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和血管生成，揭示了lncRNA CPS1-IT1作為預(yù)后預(yù)測者的潛力。lncRNA CPS1-IT1在結(jié)直腸癌組織和細胞系中低表達，可能通過抑制缺氧誘導(dǎo)因子1α的激活來抑制缺氧誘導(dǎo)的自噬，從而抑制結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[20]。本研究進行細胞增殖測定，細胞遷移和侵襲測定，來揭示lncRNA CPS1-IT1在膀胱癌中的功能。結(jié)果顯示，lncRNA CPS1-IT1的過表達顯著抑制了膀胱癌T24細胞的增殖、遷移和侵襲，以及相關(guān)蛋白Ki-67、MMP-2和MMP-9的表達，意味著lncRNA CPS1-IT1可以抑制膀胱癌的發(fā)展。同時也表明，lncRNA CPS1-IT1是一種潛在的生物標志物，可作為膀胱癌的腫瘤抑制基因。

有證據(jù)表明，lncRNA介導(dǎo)一些中藥活性成分的抗腫瘤功能，例如白藜蘆醇苷、黃芩素[21]等。根據(jù)報道，冬凌草甲素下調(diào)lncRNA AFAP1-AS1抑制胰腺癌細胞上皮向間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、遷移、侵襲和增殖[22]。lncRNA癌癥易感性候選物2(CASC2)通過在轉(zhuǎn)錄后水平上抑制B細胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2)表達來介導(dǎo)小檗堿誘導(dǎo)的促大腸癌細胞凋亡作用[23]。本研究首先發(fā)現(xiàn)，2.5 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L毛萼乙素以濃度依賴方式顯著上調(diào)lncRNA CPS1-IT1表達，由此猜想lncRNA CPS1-IT1可能參與毛萼乙素的抗膀胱癌T24細胞增殖和轉(zhuǎn)移進程。進一步的功能實驗檢測到，si-CPS1-IT1與毛萼乙素共同作用時，膀胱癌T24細胞的增殖抑制率減少，遷移、侵襲細胞數(shù)、Ki-67、MMP-2和MMP-9蛋白表達量增加，可見抑制lncRNA CPS1-IT1表達可以逆轉(zhuǎn)毛萼乙素對T24細胞增殖、遷移、侵襲的影響。這些結(jié)果表明，膀胱癌中l(wèi)ncRNA CPS1-IT1是毛萼乙素機制的關(guān)鍵靶標，介導(dǎo)毛萼乙素抗膀胱癌發(fā)生發(fā)展過程。

綜上所述，毛萼乙素可降低膀胱癌T24細胞增殖、遷移和侵襲。此外，毛萼乙素通過增加lncRNA CPS1-IT1的表達水平發(fā)揮其在膀胱癌中的抗癌作用。因此，毛萼乙素可能是膀胱癌患者的一種潛在的替代治療藥物，而lncRNA CPS1-IT1可以作為改善毛萼乙素抗癌作用的重要治療靶點。