房銳穎 張亞萍 陶云珍 黃莉莉

腸桿菌目細(xì)菌(carbapenem-resistantEnterobacteriaceae，CRE)是引起感染最常見的革蘭陰性細(xì)菌，而碳青霉烯類抗生素是目前治療革蘭陰性桿菌感染的最有效的抗生素之一。但隨著碳青霉烯類抗生素的廣泛使用，對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥的CRE檢出率呈逐年上升趨勢，嚴(yán)重加大了臨床抗感染治療難度[1]。全國耐藥監(jiān)測網(wǎng)數(shù)據(jù)[2]顯示，2019年我國部分地區(qū)碳青霉烯類耐藥的肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae，CR-KPN)檢出率已超過30%，這需要相關(guān)部門高度重視CRE的防控及治療。碳青霉烯酶的產(chǎn)生是CRE對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥的主要原因，而blaNDM、blaKPC、blaIMP、blaVIM和blaOXA-48是CRE中檢出率最多的碳青霉烯酶。不同地區(qū)、不同人群CRE的分離情況、耐藥性及主要耐藥機(jī)制均可有差異，為了解本地區(qū)兒童CRE的臨床分離及耐藥情況，本研究分析了2018～2020年蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院CRE的臨床分離情況、耐藥特點(diǎn)及 5類碳青霉烯酶的檢出情況，以期對(duì)本地區(qū)兒童CRE的臨床治療及傳播防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 2018～2020年，蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院微生物室共分離到的1 898株腸桿菌科細(xì)菌。其中182株為CRE(刪除同一患兒分離的重復(fù)菌株)。

1.2 細(xì)菌鑒定與藥敏 所有細(xì)菌分離培養(yǎng)均按照《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》[3]進(jìn)行，獲得目的菌后，采用布魯克細(xì)菌鑒定質(zhì)譜儀(MALDI Biotyper，德國布魯克公司 )進(jìn)行鑒定。藥敏采用儀器法(VITEK 2 Compact，法國梅里埃公司)測量最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)及紙片瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行，藥敏結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)采用美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)2020年判斷標(biāo)準(zhǔn)[4]。藥敏試驗(yàn)所采用的培養(yǎng)基為MH(Mueller-Hinton)瓊脂平板(安圖生物有限公司)。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922。

1.3 耐藥基因檢測 煮沸法提取細(xì)菌DNA模板，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)引物參照文獻(xiàn)[5]設(shè)計(jì)，引物由金斯瑞生物科技公司合成。引物序列及產(chǎn)物大小如表1所示。按照PCR試劑盒(2×EasyTaq? PCR SuperMix，北京全式金生物有限公司)說明書要求，反應(yīng)體系為：上下游引物各10 μmol/L，模板1 μL，PCR試劑10 μL，其余用滅菌蒸餾水補(bǔ)至20 μL。PCR反應(yīng)使用ProFlex 梯度PCR儀(美國ABI公司)進(jìn)行，擴(kuò)增參數(shù)：94℃ 預(yù)變性4 min，94℃ 變性30 s，55℃ 退火30 s，72℃ 延伸50 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃ 延伸10 min。PCR產(chǎn)物5 μL點(diǎn)樣于1.5%的瓊脂糖凝膠中，100 V電泳45 min，然后在紫外凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果。將blaNDM陽性PCR產(chǎn)物及隨機(jī)抽取的其他基因PCR產(chǎn)物一份送金唯智生物科技有限公司測序，測序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行BLAST比對(duì)后，作為陽性對(duì)照。

表1 碳青霉烯酶基因引物及產(chǎn)物大小

2 結(jié)果

2.1 CRE的分離情況

2.1.1 2018～2020年菌種的檢出情況 2018～2020年，蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院共分離得到1 898株腸桿菌科細(xì)菌，其中182株(9.59%)為CRE，以大腸埃希菌[100株(54.95%)]和肺炎克雷伯菌[71株(39.01%)]為主。見表2。

表2 2018～2020年蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院CRE檢出情況

2.1.2 科室分布情況 CRE的科室分布以新生兒科為主[72株(13.58%)]，但腎內(nèi)科CRE分離率最高[26株(23.42%)]。見表3。

表3 不同科室中CRE檢出情況

2.1.3 標(biāo)本分布情況 CRE在尿液中分離數(shù)量最多[96株(17.05%)]，但分離率最高的標(biāo)本為咽拭子[4株(40%)]。見表4。

表4 不同標(biāo)本的CRE分離情況

2.2 患兒情況 1 898株腸桿菌目細(xì)菌分離于1 812名患兒，以住院患兒為主[1 671名(92.22%)]，患兒男女比例為1.16∶1。182株CRE分離于179名患兒，其中，住院患兒173名(96.65%)。攜帶CRE的男性患兒為75名(41.90%)，女性患兒104名(58.10%)，患兒男女比例為0.72∶1。女性比男性更易分離出CRE(P=0.003)?；純阂缘妄g兒童為主，特別是新生兒，隨著年齡增大，CRE的分離率隨之下降。見表5。

表5 攜帶CRE的患兒年齡分布情況

2.3 CRE藥物敏感情況 CR-ECO對(duì)氨基糖苷類的慶大霉素耐藥率(25%)最低，其余抗生素耐藥率均高于80%。CR-KPN對(duì)氨基糖苷類的慶大霉素(21.13%)、妥布霉素(23.94%)以及喹諾酮類的左氧氟沙星(33.80%)耐藥率較低外，其余各類抗生素耐藥率均大于50%。見表6。

表6 CR-ECO及CR-KPN的藥物耐藥情況

2.4 耐藥基因檢測情況 在182株CRE中，隨機(jī)挑選127株檢測其blaNDM、blaKPC、blaIMP、blaVIM及blaOXA‐48基因，包括肺炎克雷伯菌61株，大腸埃希菌62株，陰溝腸桿菌2株，產(chǎn)酸克雷伯菌1株，產(chǎn)氣腸桿菌1株。共有74株(58.27%)CRE檢測出上述5類碳青霉烯酶基因。其中，肺炎克雷伯菌菌檢出47株(63.51%)，大腸埃希菌檢出25株(33.78%)，陰溝腸桿菌檢出1株(1.35%)，產(chǎn)酸克雷伯菌檢出為1株(1.35%)。其中19株(40.43%)肺炎克雷伯菌，4株(16.00%)大腸埃希菌同時(shí)表達(dá)2種碳青霉烯酶基因，8株(17.02%)肺炎克雷伯菌同時(shí)表達(dá)3種碳青霉烯酶基因。共有42株CRE檢出了blaNDM基因，其中，15株產(chǎn)NDM-2酶，25株產(chǎn)NDM-5酶，2株產(chǎn)NDM-9酶。見表7。

表7 肺炎克雷伯菌及大腸埃希菌中5種碳青霉烯酶的檢出情況(株)

3 討論

細(xì)菌耐藥株的分布受多種因素影響，如地區(qū)、人群、衛(wèi)生條件、抗生素使用情況等，及時(shí)監(jiān)測耐藥菌的流行特征有利于控制耐藥菌的播散。目前有關(guān)兒童CRE流行病學(xué)數(shù)據(jù)較少。本研究分析了2018～2020年蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院CRE的流行特征及耐藥特征，以期對(duì)蘇州地區(qū)兒童CRE的預(yù)防及治療提供依據(jù)。

2018～2020年，蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院CRE以CR-ECO(100株)為主，CR-KPN(71株)次之，平均檢出率為9.59%。略高于2018年全國兒童平均檢出率(8.7%)[6]，而成人以CR-KPN 為主，CR-ECO次之[7-8]。近3年，蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院CR-ECO分離率分別為7.96%、6.76%和14.24%，均高于全國耐藥監(jiān)測網(wǎng)公布的江蘇省CR-ECO分離率(2018年2.7%，2019年2.6%)。提示CR-ECO是本地區(qū)兒童感染的優(yōu)勢菌，且耐藥形勢嚴(yán)峻，需要高度重視。

在蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院，CRE分離部位前3位為尿路感染(96株)、呼吸道感染(58株)和血液感染(16株)。與日本地區(qū)研究[9]結(jié)果類似，但與鄭州地區(qū)及成都地區(qū)兒童CRE(主要來源于呼吸道標(biāo)本)分離情況不同[10]。分離CRE最多的科室依次為新生兒科(39.56%)、腎內(nèi)科(14.29%)、ICU(13.19%)和血液科(13.19%)。與全國耐藥監(jiān)測網(wǎng)(http://www.carss.cn/Report)中公布的近年全國平均數(shù)據(jù)及王冰潔等[11]研究數(shù)據(jù)相吻合?？赡苁且?yàn)樾律鷥荷戆l(fā)育尚未完善、免疫力較弱，且適合使用的抗生素劑量、種類較為局限等因素導(dǎo)致了新生兒科CRE分離數(shù)量較多。此外，住院時(shí)間較長、插管等因素也會(huì)增加CRE在院內(nèi)播散。

本研究中，58.27%的CRE檢出了5種常見碳青霉烯酶，以NDM型為主，KPC型次之。其中，blaNDM以NDM-5型為主，NDM-2型次之。而成人CRE以blaKPC為主，blaNDM次之[2]。與蘇州鄰近的上海地區(qū)blaNDM以NDM-1為主，NDM-5次之[12]。提示不同人群、不同地區(qū)的CRE分離情況有差異。近年來，全球各地陸續(xù)有CRE共表達(dá)多個(gè)碳青霉烯酶的報(bào)道[13]。本研究中也發(fā)現(xiàn)多株CRE同時(shí)表達(dá)多種碳青霉烯酶基因。特別是表達(dá)blaVIM，以及表達(dá)blaNDM的CR-KPN更傾向于共表達(dá)其他碳青霉烯酶。與blaVIM共表達(dá)最多的是blaNDM(13株，56.52%)，其次為blaOXA-48(11株，47.83%)。與blaNDM共表達(dá)最多的是blaVIM(13株，81.25%)，其次為blaOXA-48(7株，43.75%)。Bush等[13]發(fā)現(xiàn)，成人CRE中與blaVIM共表達(dá)最多的是blaKPC，與blaNDM共表達(dá)最多的是blaOXA-48。不同型別的碳青霉烯酶對(duì)抗生素的水解作用不同[14]，而同時(shí)產(chǎn)生多種類型的碳青霉烯酶，易導(dǎo)致單一藥物治療無效，需要聯(lián)合治療或者研發(fā)新的復(fù)合型抗生素，增加了治療的難度。

綜上所述，蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院CRE分離率較高。主要表達(dá)的碳青霉烯酶譜與成人及其他地區(qū)兒童存在差異，且存在多株CRE同時(shí)表達(dá)不同種碳青霉烯酶。因此，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)本地區(qū)患兒CRE攜帶情況的監(jiān)測，規(guī)范兒童抗生素使用，持續(xù)重視并采取有效措施來預(yù)防及控制耐藥基因在院內(nèi)的水平傳播。