李 娜，寧程程，郭 蘊，季春輝，王立霞，張亞萍，孟慶玲，喬 軍，才學(xué)鵬

(1.石河子大學(xué) 動物科技學(xué)院，新疆 石河子 832003；2.中國獸藥監(jiān)察所，北京 100081)

沙門菌被世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)確定為引起重大疾病和死亡的食源性病原體[1]。沙門菌在自然界中分布廣泛，可感染人類、家畜和家禽，引起人類腸炎和畜禽、犬、貓及試驗動物發(fā)生副傷寒；同時還可導(dǎo)致在牛、羊和馬流產(chǎn)及急性胃腸炎，具有較強的致病性。對于老人、兒童以及有免疫缺陷的人還會造成生命危險[2]?？股氐拈L期使用，導(dǎo)致沙門菌引起的感染日趨嚴重，對全球公共衛(wèi)生造成嚴重威脅[3-4]。因此，深入研究沙門菌侵染和致病的分子機制，對于該病的科學(xué)防控及公共衛(wèi)生安全具有重要的意義。

細菌非編碼小RNA(sRNAs)是細菌的一種重要調(diào)控分子，通常位于基因間隔區(qū)(IGRs)中，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達方面發(fā)揮重要作用[5-6]。細菌sRNAs在不同的環(huán)境中廣泛表達，可調(diào)節(jié)包括鐵穩(wěn)態(tài)、外膜蛋白的生物合成、群體感應(yīng)和毒力等多種生命活動過程[7-8]。近年來隨著高通量測序技術(shù)的不斷發(fā)展，已在沙門菌 SL1344株的基因組中發(fā)現(xiàn)并鑒定了280種sRNAs[9]，然而其大部分sRNAs的生物學(xué)特性暫不清楚，Srikumar等[10]研究發(fā)現(xiàn)，sRNASTnc1220在沙門菌感染巨噬細胞時該基因表達水平顯著下調(diào)，推測STnc1220可能與沙門菌侵染及環(huán)境應(yīng)激相關(guān)。然而，至今sRNASTnc1220生物學(xué)功能尚不清楚。

本研究通過克隆STnc1220基因，分析其分子特征，并利用λ-Red重組技術(shù)對sRNASTnc1220進行基因缺失株的構(gòu)建，比較缺失株與親本株之間生物學(xué)特性的差異，旨在為揭示sRNASTnc1220在沙門菌環(huán)境應(yīng)激和毒力的調(diào)控作用及機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌株、質(zhì)粒和試劑

鼠傷寒沙門菌SL1344標準毒株、大腸桿菌(E.coli)DH5α、RAW264.7細胞、質(zhì)粒 pKD46、pKD3、pCP20和PBR322 均由石河子大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實驗室保存。試驗動物均為6周齡BALB/c小鼠(雌雄各半)，購自新疆醫(yī)科大學(xué)。PCR Mix、DNA Marker，pMD19-T載體和T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶均購自大連寶生物公司。

1.2 引物設(shè)計

根據(jù)GenBank中已經(jīng)發(fā)布的沙門菌 SL1344株基因組序列(登錄號：FQ312003.1)，使用DNAStar軟件設(shè)計引物。P1/P2用于sRNASTnc1220擴增及缺失驗證，P3/P4引物用于擴增打靶片段，其5′端含有50 bp部分與sRNASTnc1220基因序列同源，3′端與氯霉素抗性基因cat(來源于質(zhì)粒pKD3)同源。引物均由北京華大生物公司合成(表 1)。

表1 PCR擴增所需引物Tab.1 Primers required for PCR amplification

1.3 沙門菌 STnc1220基因擴增及分子特征分析

提取SL1344基因組并作為模板，P1/P2為引物PCR擴增出沙門菌非編碼sRNASTnc1220。PCR反應(yīng)體系：PCR Mixture 10 μL，H2O 7 μL，DNA 模板 2 μL，上下游引物各 0.5 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min，16 ℃保存。對目的條帶進行膠回收，與pMD19-T載體經(jīng)16 ℃過夜連接，篩選陽性單菌落并送測序。對測序結(jié)果進行啟動子序列分析。利用RNAtarget 2在線軟件(http：//RNA.informatik.uni-freiburg.de/)進行STnc1220所調(diào)控靶基因的預(yù)測。

1.4 沙門菌 STnc1220基因缺失株的構(gòu)建

提取pKD3質(zhì)粒并作為模板，P3/P4為引物PCR擴增出含有STnc1220基因上、下游同源臂的打靶片段，進行重疊融合PCR(SOE-PCR)擴增。將目的基因進行回收和測序。制備SL1344感受態(tài)細胞，電轉(zhuǎn)入pKD46質(zhì)粒，然后將擴增出的打靶片段電轉(zhuǎn)入SL1344-pKD46 感受態(tài)細胞，用含有 Amp 和 Cm 抗性的 LB 平板篩選陽性轉(zhuǎn)化子(ΔSTnc1220∷cat)進行PCR鑒定和測序驗證。將pCP20質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入ΔSTnc1220∷cat感受態(tài)細胞中(已消除pKD46質(zhì)粒)，用含有氨芐抗性的LB平板進行篩選，獲得缺失株ΔSTnc1220。

1.5 STnc1220基因缺失對沙門菌生長及生化特性的影響

將3株菌在LB液體培養(yǎng)基連續(xù)傳代培養(yǎng)至50代，選取第10，20，30，40，50代細菌，用STnc1220基因內(nèi)部引物P1/P2進行PCR擴增鑒定其是否具備遺傳穩(wěn)定性。參照文獻[11]的方法，分別將3株菌接種BHI培養(yǎng)基中，將過夜培養(yǎng)物按1∶100轉(zhuǎn)接新BHI，37 ℃同步振搖培養(yǎng)，通過測定菌液OD600繪制各菌株生長曲線。挑取3株菌的單菌落至木糖、棉子糖、葡萄糖、氰化鉀、枸櫞酸鈉、硫化氫等生化鑒定管，放置37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)靜置培養(yǎng)18～24 h，按操作說明書觀察其生化特性。

1.6 STnc1220基因缺失對沙門菌生物被膜形成的影響

將親本株和缺失株過夜培養(yǎng)次日轉(zhuǎn)接于新鮮LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至菌液OD600≈0.2，以每孔200 μL加入96孔微孔板中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。按照參考文獻[12]方法，將菌液吸出后用200 μL去離子水清洗3次，室溫晾30 min后每孔加入1%結(jié)晶紫100 μL染色45 min，PBS清洗3次；將96孔微孔板置于室溫自然晾干，加入95%的乙醇進行脫色，酶標儀測定其OD600。

1.7 STnc1220基因缺失對沙門菌環(huán)境應(yīng)激的影響

挑取親本株和缺失株的單菌落于BHI培養(yǎng)基中，37 ℃ 180 r/min培養(yǎng)12 h，以1∶100比例分別轉(zhuǎn)接于pH=4.8、pH=9、4% NaCl、2 mmol/L的H2O2、3.8%乙醇的新鮮BHI液體培養(yǎng)基中，調(diào)整其初始OD600相同時，置于37 ℃振蕩培養(yǎng)箱180 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔1 h取樣測OD600值并繪制生長曲線。

1.8 STnc1220基因缺失對沙門菌細胞黏附和侵襲能力的影響

取生長狀態(tài)良好的RAW264.7細胞用無菌PBS洗滌3次后用DMEM重懸備用，用預(yù)冷無菌 PBS將新鮮培養(yǎng)的親本株和缺失株洗滌后調(diào)整OD600為0.5后置于冰上。參考文獻[13]的方法，菌液以感染復(fù)數(shù)MOI=10侵染細胞，分別進行細胞黏附、侵襲試驗，梯度稀釋，涂板計數(shù)。

1.9 STnc1220基因缺失對沙門菌致病力的影響

將沙門菌 SL1344、ΔSTnc1220培養(yǎng)至對數(shù)生長中期，收集菌體并用預(yù)冷的無菌PBS洗滌3次，以無菌 PBS重懸菌體并進行連續(xù)10倍倍比稀釋。分別以1.0×108，1.0×107，1.0×106，1.0×105，1.0×104，1.0×103cfu/mL的劑量腹腔感染 BALB/c小鼠，注射無菌PBS作為對照組，攻毒之后觀察10 d，記錄小鼠發(fā)病及死亡情況，使用改良寇氏法計算每株菌的半數(shù)致死量LD50。分別對6周齡小鼠注射1.0×104cfu/mL的親本株、缺失株進行腹腔感染。取感染第5 天的小鼠處死后無菌收集它們的肝臟和脾臟，經(jīng)固定后制作成組織切片進行病理學(xué)觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙門菌 sRNA STnc1220基因擴增及分子特征分析

以P1/P2引物擴增出的片段大小為275 bp，測序結(jié)果顯示，其中sRNASTnc1220基因大小為73 bp，位于基因ssaK和ssaL之間。預(yù)測顯示在sRNASTnc1220的上游5′-UTR區(qū)域存在-10和-35區(qū)啟動子核心序列。靶基因預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，sRNA的47—54位可與barA基因mRNA的5′-UTR端-50—-57位堿基互補配對(圖1)。

A.STM STnc1220基因克?。篗.DNA Marker DL2000；1.陰性對照；2.sRNA STnc1220基因。B.STM STnc1220基因的測序分析。C.sRNA STnc1220與靶基因barA的互補配對位置。A.STM STnc1220 gene clone：M.DNA Marker DL2000;1.Negative control;2.sRNA STnc1220 gene.B.Sequencing analysis of STM STnc1220 gene.C.Complementary pairing position of sRNA STnc1220 and target gene barA.

2.2 沙門菌 STnc1220基因缺失株的構(gòu)建與鑒定結(jié)果

以pKD3質(zhì)粒為模板，P3/P4引物擴增出的打靶片段為1 159 bp，與預(yù)期大小一致(圖2-A)。以P1/P2引物擴增出的sRNASTnc1220、ΔSTnc1220∷cat、ΔSTnc1220片段大小分別為275 ，1 261，330 bp(圖2-B)。PCR擴增及測序結(jié)果證明缺失株ΔSTnc1220構(gòu)建成功。

A.STnc1220打靶片段：M.Marker DL2000；1.陰性對照；2.打靶片段。B.沙門菌ΔSTnc1220的鑒定：M.Marker DL2000；1.陰性對照；2.sRNA STnc1220基因；3.ΔSTnc1220∷cat擴增產(chǎn)物；4.ΔSTnc1220基因擴增產(chǎn)物。A.STnc1220 targeting fragment：M.Marker DL2000；1.Negative control；2.Targeting fragment.B.Identification of STM ΔSTnc1220:M.Marker DL2000；1.Negative control；2.sRNA STnc1220 gene；3. ΔSTnc1220∷cat amplification product；4.ΔSTnc1220 gene amplification product.

2.3 沙門菌 STnc1220基因缺失株生長與生化特性分析

PCR擴增結(jié)果顯示，連續(xù)傳代的第10，20，30，40，50代的細菌，其凝膠電泳擴增條帶大小一致，表明缺失株沙門菌ΔSTnc1220具有良好的遺傳穩(wěn)定性(圖3)。生長曲線結(jié)果表明，親本株和缺失株在37 ℃培養(yǎng)條件下的生長速率基本相同，表明sRNASTnc1220基因缺失不影響鼠傷寒沙門菌的生長特性(圖4)。缺失株ΔSTnc1220和親本株的生化特性相同，證明sRNASTnc1220基因缺失不影響鼠傷寒沙門菌的生化特性。

圖3 ΔSTnc1220遺傳穩(wěn)定性PCR驗證Fig.3 Identification genetically stable of ΔSTnc1220 by PCR

圖4 生長曲線測定Fig.4 Growth curve measurement

2.4 STnc1220基因缺失對沙門菌生物被膜形成的影響

生物膜形成結(jié)果顯示，測得的野生株OD600為1.22，缺失株OD600為1.17，由此可知，野生株和缺失株生物膜形成能力差異不顯著(P>0.05)，表明缺失株沙門菌ΔSTnc1220不影響生物被膜的形成。

2.5 STnc 1220基因缺失對沙門菌環(huán)境應(yīng)激的影響

與親本株相比，缺失株在pH=4.8、pH=9和含有2 mmol/L 30% H2O2條件下差異性不顯著(P>0.05)；在4% NaCl的BHI液體培養(yǎng)基中，缺失株在7 h后生長速率明顯高于親本株(P<0.05)； 在含有3.8%乙醇的條件下，缺失株在4～8 h的生長顯著高于親本株(P<0.05)(圖5)。

不同小寫字母表示差異顯著( P<0.05)。Different lowercase letters indicate significant differences(P<0.05).

2.6 STnc1220基因缺失對沙門菌細胞黏附和侵襲能力的影響

與親本株SL1344相比，缺失株ΔSTnc1220對細胞的侵襲率下降了88.66%；黏附率下降了62.76%，(圖6)，提示STnc1220缺失后沙門菌細胞黏附和侵襲能力極顯著降低(P<0.01)。

同組織間不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)；不同組織間未做顯著性分析。Different capital letters in the same tissue showed significant differences(P<0.01)；There was no significantly different analysis between different tissues.

2.7 STnc 1220基因缺失對沙門菌致病力的影響

沙門菌 SL1344和ΔSTnc1220的LD50分別是6.46×104，1.48×105cfu/mL，但缺失株小鼠生存時間明顯延長(表2、圖7)，表明缺失株沙門菌ΔSTnc1220毒力顯著低于親本株。解剖及觀察組織切片發(fā)現(xiàn)，與PBS對照組相比，SL1344和ΔSTnc1220均出現(xiàn)明顯的病理學(xué)變化(圖8)。肝臟出現(xiàn)出血，邊緣明顯，組織學(xué)出現(xiàn)肝索排列不規(guī)則，竇狀隙擴張，出現(xiàn)細胞核溶解，單核細胞浸潤；脾臟明顯腫大，出現(xiàn)紅髓白髓界限模糊，紅髓充血、散在性出血，白髓變小，有大量淋巴細胞浸潤。與SL1344相比，ΔSTnc1220的組織病理學(xué)改變較輕，表明STnc1220基因缺失可降低沙門菌對小鼠器官的病理損傷能力。

表2 6周齡小鼠腹腔注射SL1344、ΔSTnc1220菌株后LD50的測定Tab.2 Determination of LD50 after intraperitoneal injection of SL1344 and ΔSTnc1220 strains in 6-week-old mice

圖7 不同菌株感染小鼠死亡生存曲線Fig.7 Death and survival curve of mice by intraperitoneal infected with different strains

圖8 SL1344、ΔSTnc1220感染小鼠臟器的病理學(xué)變化Fig.8 Pathological changes of organs in mice infected with SL1344 and ΔSTnc1220

3 結(jié)論與討論

現(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)，sRNA可通過堿基配對與靶mRNA相互結(jié)合，通過多種方式在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達，從而調(diào)節(jié)細菌的物質(zhì)代謝、環(huán)境適應(yīng)性、毒力等多個生理過程[14]。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的細菌sRNA對靶基因mRNA的調(diào)控主要包括以下幾種：第一，sRNA與靶mRNA的結(jié)合，可增強靶基因mRNA穩(wěn)定性，防止Rnase E對靶基因mRNA的降解，發(fā)揮正調(diào)控作用[15]。其次，sRNA與靶mRNA的結(jié)合形成雙鏈后，可誘導(dǎo)Rnase Ⅲ的降解，對靶基因的表達發(fā)揮負調(diào)控作用[16]。第三，sRNA與靶mRNA的結(jié)合，可打開靶基因mRNA遮蔽核糖體結(jié)合位點(RBS)的二級結(jié)構(gòu)，有利于核糖體30S與RBS的結(jié)合，從而促進靶蛋白的翻譯。此外，sRNA可與靶mRNA上的RBS結(jié)合，抑制核糖體30S與RBS的結(jié)合，從而抑制靶蛋白的翻譯[17]。Houserova等[14]研究鑒定了在沙門菌SL1344基因組中差異表達的475個sRNA，然而大部分sRNA 的生物學(xué)功能和致病性尚不清楚。Kim等[18]發(fā)現(xiàn)，sRNARaoN可抑制NADPH氧化酶介導(dǎo)的ROS產(chǎn)生，控制亞硝化氧化應(yīng)激抗性。Chien等[19]驗證了在厭氧環(huán)境下，sRNAFnrS可以通過與其靶基因堿基配對來抑制 mRNAMetE+基因的表達。陳斌杰等[20]發(fā)現(xiàn)，sRNARyhB可增強沙門菌的侵襲力進而調(diào)控沙門菌的毒力。Meng等[5]研究表明，sRNASTnc640可以調(diào)控腸炎沙門菌菌毛基因的表達，影響?zhàn)じ絹硪种粕抽T菌的毒力。由于沙門菌 sRNA對靶mRNA的調(diào)控方式具有明顯的多樣性，這可能也是沙門菌具有廣泛的感染譜(能在多種動物體內(nèi)生存繁殖)和較強的環(huán)境適應(yīng)能力(耐酸和胞內(nèi)生存)的重要原因之一。

在細菌中，許多 sRNA可以直接感知多種環(huán)境信號[10]。本研究結(jié)果顯示，STnc1220的缺失后增強了對高滲、乙醇環(huán)境的適應(yīng)能力，表明 sRNASTnc1220在對外界應(yīng)激環(huán)境發(fā)揮了一定作用。同時，本研究通過RNAtarget 2軟件預(yù)測出 sRNASTnc1220的47—54位堿基可和barAmRNA的5′-UTR端-50—-57位堿基互補配對，提示STnc1220調(diào)控的靶基因為barA。有研究發(fā)現(xiàn)，barA是入侵基因表達和細菌穿透上皮細胞所需的磷酸化類型的傳感器激酶，與反應(yīng)調(diào)節(jié)分子SirA構(gòu)成了一個雙組分調(diào)節(jié)劑，誘導(dǎo)SPI-1基因的表達以響應(yīng)未知的細胞外信號[21]。Fortune等[22]研究證實ΔbarA對細胞的侵襲能力與親本株相比顯著降低；Altier等[23]發(fā)現(xiàn)，barA的缺失對入侵基因表達的調(diào)控顯著降低。因此，本研究推測STnc1220可通過調(diào)控靶基因barA的表達來調(diào)節(jié)細菌的致病力，上述推測還需要通過進一步研究來證實。

總之，本研究通過λ-Red方法構(gòu)建了沙門菌STnc1220基因缺失株ΔSTnc1220，驗證了STM-ΔSTnc1220的部分生物學(xué)特性，證實STnc1220在沙門菌侵襲黏附細胞及致病力上發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。