連凱琪，紀(jì) 爽，2，周玲玲，時(shí)志琪，王 飛，2，張?jiān)迹?

(1.安陽(yáng)工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，河南 安陽(yáng) 455000；2.河南省太行山林業(yè)有害生物野外科學(xué)觀測(cè)研究站，河南 林州 456550)

黏蟲(chóng)(Mythimnaseparate)是遠(yuǎn)距離遷飛的典型害蟲(chóng)，給我國(guó)及世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前蛋白酶主要分為絲氨酸蛋白酶、巰基蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶和谷氨酸蛋白酶等，其中絲氨酸蛋白酶是黏蟲(chóng)等鱗翅目昆蟲(chóng)中腸蛋白酶的主要活性成員。絲氨酸蛋白酶家族是一類跨膜嵌合蛋白酶超家族，主要參與到降解蛋白質(zhì)、防御細(xì)菌侵害、凝血過(guò)程、補(bǔ)體系統(tǒng)等生化反應(yīng)中[1]。結(jié)構(gòu)上，絲氨酸蛋白酶屬于β蛋白，其催化中心主要由3個(gè)氨基酸組成，其中Ser有重要的作用，被定位于C端結(jié)構(gòu)域上，其他2個(gè)(Asp和His)在N端結(jié)構(gòu)域上。另外，包括底物結(jié)合位點(diǎn)和底物特異性口袋等行使重要功能的位點(diǎn)均位于C端結(jié)構(gòu)域，因此，絲氨酸蛋白酶的C端結(jié)構(gòu)域是主要功能區(qū)，而保證催化中心三聯(lián)體的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性主要是N端結(jié)構(gòu)域在發(fā)揮作用[2]。近些年，世界上眾多的學(xué)者已經(jīng)從許多昆蟲(chóng)體內(nèi)克隆得到多種絲氨酸蛋白酶基因，并對(duì)其進(jìn)行了生物學(xué)分析以及先天免疫、消化等生理功能的研究。其中，在盲蝽(Creontiadesdilutes)、甘藍(lán)夜蛾(Mamestrabrassica)、蓖麻夜蛾(Achaeajanata)、飛揚(yáng)阿夜蛾(Achaeajanata)等昆蟲(chóng)中都有絲氨酸蛋白酶研究的報(bào)道[3-4]，在美洲棉鈴蟲(chóng)(Helicoverpazea)、球菜夜蛾(Agrotisipsilon)、家蠶(Bombyxmori)、野桑蠶(Bombyxmandarina)和煙芽夜蛾(Heliothisvirescens)等昆蟲(chóng)體內(nèi)擴(kuò)增到多條絲氨酸蛋白酶基因[5-6]。Lange等[7]利用Sf21昆蟲(chóng)表達(dá)系統(tǒng)，獲取了有活性的大型溞(Daphniamagna)絲氨酸蛋白酶；周曉群等[8]利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了苜蓿夜蛾(Heliothisdipsacea)中腸中克隆的絲氨酸蛋白酶基因。目前，研究者主要對(duì)黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)、家蠶、煙草天蛾(Manducasexta)等生物體內(nèi)的絲氨酸蛋白酶的基因序列和生理功能開(kāi)展了研究，而對(duì)于黏蟲(chóng)絲氨酸蛋白酶的相關(guān)研究較少。Zhou等[9]曾克隆了2種黏蟲(chóng)中腸絲氨酸蛋白酶基因，并研究了其在食物消化中的作用。

本研究克隆了一種新的黏蟲(chóng)絲氨酸蛋白酶基因(MsPG)，首先采用RACE技術(shù)克隆黏蟲(chóng)中腸絲氨酸蛋白酶的全長(zhǎng)基因，然后通過(guò)大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)黏蟲(chóng)絲氨酸蛋白酶，為進(jìn)一步研究絲氨酸蛋白酶基因的功能奠定基礎(chǔ)，也為黏蟲(chóng)新型殺蟲(chóng)劑的研發(fā)提供新的靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

所用昆蟲(chóng)由黑光燈誘捕方法捕獲，用約8%蜂蜜水飼養(yǎng)于安陽(yáng)工學(xué)院生物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，待其產(chǎn)卵，將卵置于25 ℃、濕度約75%、光照周期14L∶10D的培養(yǎng)箱中利用小麥葉片進(jìn)行飼養(yǎng)，得到四齡幼蟲(chóng)備用。

RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RNA酶抑制劑、DL2000 DNA Marker、2×PCR master mix、TaqDNA 聚合酶、質(zhì)粒提取試劑盒、EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ 限制性內(nèi)切酶、Premixed Protein Marker(low)、T4-DNA連接酶、通用引物M13F/R和T7F/R購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；RACE試劑盒購(gòu)自Clontech公司；DNA膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司；pEASY-T3 Cloning Vector購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；TRIzol購(gòu)自Invitrogen公司；pET30a(+)Vector、E.coliDH5α和BL21感受態(tài)細(xì)胞由安陽(yáng)工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心保存。

1.2 絲氨酸蛋白酶部分基因的擴(kuò)增

在生理鹽水中解剖四齡黏蟲(chóng)幼蟲(chóng)獲取中腸，充分快速研磨后按照TRIzol提取RNA的方法提取總RNA。按照RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說(shuō)明書(shū)，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)NCBI GenBank上發(fā)表的鱗翅目昆蟲(chóng)粉蚊夜蛾(Trichoplusiani，登錄號(hào)：XM_026875618.1)、斜紋夜蛾(Spodopteralitura，登錄號(hào)：XM_022965589.1)等昆蟲(chóng)的絲氨酸蛋白酶序列信息，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物Ser-PRF和Ser-PRR(表1)。以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增MsPG的部分基因。PCR擴(kuò)增體系：cDNA模板 1 μL，Ser-PRF和Ser-PRR(20 μmol/L)各0.5 μL，2×PCR master mix 25 μL，加ddH2O補(bǔ)充至50 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 4 min；94 ℃ 40 s，56 ℃ 35 s，72 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。將PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1% 瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收目的片段，并構(gòu)建到pEASY-T3克隆載體上，選擇陽(yáng)性質(zhì)粒送蘇州金唯智生物科技有限公司測(cè)序。

表1 試驗(yàn)所用引物序列Tab.1 Primer sequences used in the study

1.3 絲氨酸蛋白酶兩端基因的擴(kuò)增和基因全長(zhǎng)序列拼接

根據(jù)1.2中克隆測(cè)序獲得的MsPG基因部分序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增5′端和3′端的引物5GSP和5NGSP以及3GSP和3NGSP(表1)。以1.2中提取的總RNA為模板，按照參考文獻(xiàn)[10]中的方法，分別擴(kuò)增MsPG基因的5′端和3′端，并構(gòu)建到pEASY-T3載體上進(jìn)行測(cè)序。將獲得的5′端和3′端基因序列以及1.2中獲得的MsPG部分基因序列進(jìn)行拼接，得到MsPG的全長(zhǎng)序列。

1.4 絲氨酸蛋白酶基因和編碼蛋白的分析

將MsPG的全長(zhǎng)序列在NCBI-Blast上進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)而利用NCBI中的ORF Finder對(duì)開(kāi)放閱讀框(ORF)進(jìn)行在線預(yù)測(cè)。根據(jù)基因序列推導(dǎo)其氨基酸序列，通過(guò)SignalP 4.1 Server對(duì)其信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)，通過(guò)Protparam軟件在線預(yù)測(cè)其分子質(zhì)量和等電點(diǎn)。然后，采用DNAMAN 7.0軟件對(duì)不同物種間絲氨酸蛋白酶氨基酸序列進(jìn)行多重聯(lián)配分析，利用MEGA 5.0軟件中最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.5 重組質(zhì)粒pET30a(+)-MsPG的構(gòu)建

根據(jù)1.4中對(duì)ORF和信號(hào)肽的預(yù)測(cè)，將ORF基因去掉信號(hào)肽序列后進(jìn)行引物設(shè)計(jì)(pr1F和pr1R)，同時(shí)引入限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和Hind Ⅲ的酶切位點(diǎn)(表1)。以1.2中合成的cDNA為模板，按照1.2中的PCR擴(kuò)增體系和方法進(jìn)行基因擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，切下目的條帶進(jìn)行膠回收。使用EcoRⅠ和Hind Ⅲ分別對(duì)膠回收的目的片段和pET30a(+)載體進(jìn)行雙酶切，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，按照一定比例將酶切后的目的片段和pET30a(+)載體混勻，在T4-DNA連接酶的作用下16 ℃連接過(guò)夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布含卡那霉素的LB固體平板上，37 ℃恒溫箱培養(yǎng)15 h，挑取單克隆菌落搖菌12 h，提取質(zhì)粒進(jìn)行鑒定，將鑒定陽(yáng)性的質(zhì)粒送蘇州金唯智生物科技有限公司測(cè)序。

1.6 重組質(zhì)粒pET30a(+)-MsPG的表達(dá)

將重組質(zhì)粒和空載體質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化E.coliBL21感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含卡那霉素的LB固體平板上，37 ℃恒溫箱培養(yǎng)12 h。挑取單克隆菌落置于10 mL含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，搖菌14 h。取200 μL菌液接種于10 mL含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，制取5管。同時(shí)設(shè)置1管空載體表達(dá)菌液作為陰性對(duì)照。將6管菌液置于37 ℃搖床中，200 r/min搖菌約3 h(OD600≈0.6)。向5管重組質(zhì)粒菌液中加入IPTG(終濃度0.1 mmol/L)，分別置于20，25，30，35，40 ℃搖床內(nèi)，180 r/min誘導(dǎo)8 h。同時(shí)向pET30a(+)空質(zhì)粒菌液加入相同濃度IPTG，置于20 ℃、180 r/min條件下誘導(dǎo)8 h，作為對(duì)照組。分別從6管菌液中取1.5 mL菌液到6個(gè)離心管中，13 000 r/min、25 ℃離心5 min，棄上清，收集菌體。用PBS重懸菌體，并加入蛋白質(zhì)電泳上樣緩沖液，沸水煮10 min，然后12 000 r/min離心1 min，吸取10 μL上清液進(jìn)行SDS-PAGE分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 MsPG基因cDNA序列的擴(kuò)增

通過(guò)反轉(zhuǎn)錄PCR獲得MsPG基因部分核苷酸序列，共977 bp，之后利用Clontech公司的RACE試劑盒和自行設(shè)計(jì)的特異性RACE引物，擴(kuò)增得到863 bp的5′端序列和約490 bp的3′端序列(圖1)。將獲得的核苷酸序列進(jìn)行拼接得到目的基因全序列共2 010 bp，并命名為MsPG。隨后通過(guò)ORF全長(zhǎng)的擴(kuò)增和測(cè)序進(jìn)一步驗(yàn)證了MsPG基因。

M.DL2000 DNA 標(biāo)記；1.MsPG片段的PCR產(chǎn)物；2.5′ RACE產(chǎn)物；4.3′ RACE產(chǎn)物；3，5.5′ RACE 和 3′ RACE的陰性對(duì)照。M.DL2000 DNA Marker；1.PCR product of partial MsPG gene；2.PCR product of MsPG by 5′ RACE；4.PCR product of MsPG by 3′ RACE；3，5.The negative control of 5′ RACE and 3′ RACE.

2.2 MsPG基因和編碼蛋白的分析

利用DNAMAN 7.0對(duì)所得到的全長(zhǎng)序列進(jìn)行分析，結(jié)果如圖2所示，MsPG基因序列為2 010 bp，末端帶有典型的Poly(A)尾。NCBI ORF Finder預(yù)測(cè)的ORF為1 593 bp，編碼530個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量為67.6 ku，等電點(diǎn)7.63。SignaIP 4.1預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，其N端有一段長(zhǎng)21個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽。參考已報(bào)道文獻(xiàn)[9]，發(fā)現(xiàn)MsPG活性中心為GDSGGP(圖2)。根據(jù)于潔等[11]的報(bào)道，發(fā)現(xiàn)MsPG具有含6個(gè)半胱氨酸的clip結(jié)構(gòu)域(圖2)，推測(cè)其屬于clip型絲氨酸蛋白酶。

信號(hào)肽序列用淺藍(lán)色陰影表示；活性中心(GDSGGP)用紅色陰影表示；下劃線部分為clip結(jié)構(gòu)域；6個(gè)半胱氨酸由方框標(biāo)記。

2.3 MsPG編碼的氨基酸序列比對(duì)

將MsPG編碼的氨基酸序列在NCBI-Blast上進(jìn)行搜索，顯示其與鱗翅目昆蟲(chóng)的絲氨酸蛋白酶序列相似性為70.00%～91.92%，其中與煙芽夜蛾(登錄號(hào)：PGG78401.1)的一致性最高，為91.92%。使用DNAMAN對(duì)黏蟲(chóng)和代表性昆蟲(chóng)的絲氨酸蛋白酶氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)，發(fā)現(xiàn)它們都具有絲氨酸蛋白酶的活性中心GDSGGP(圖3)。

下劃線表示氨基酸序列為活性中心GDSGGP。深色背景表示一致性為100%，紅色背景表示一致性大于等于75%，淺藍(lán)色背景表示一致性大于等于50%。HvB5.煙芽夜蛾(登錄號(hào)：PCG78401.1)；HaPE.棉鈴蟲(chóng)(登錄號(hào)：XP_021187378.1)；S1TS.斜紋夜蛾(登錄號(hào)：XP_022821357.1)；AtX1.臍橙螟(登錄號(hào)：XP_013191307.1)；BaPS.叢林斜眼蝶(登錄號(hào)：XP_023945684.1)；PxPZ.柑橘鳳蝶(登錄號(hào)：XP_013176912.1)；PpPE.玉帶鳳蝶(登錄號(hào)：XP_013135138.1)；DpPE.黑脈金斑蝶(登錄號(hào)：XP_032527749.1)；GmPE.大蠟螟(登錄號(hào)：XP_026758758.1)；AtX2.臍橙螟(登錄號(hào)：XP_013191309.1)；ApUN.燈蛾屬(登錄號(hào)：CAB3239924.1)；MsPE.煙草天蛾(登錄號(hào)：XP_030031627.1)。

利用MEGA 5.0軟件中的最大似然法構(gòu)建了絲氨酸蛋白酶的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果顯示，黏蟲(chóng)MsPG與斜紋夜蛾、煙芽夜蛾和棉鈴蟲(chóng)(Helicoverpaarmigera)的絲氨酸蛋白酶遺傳距離較近(圖4)。

圖4 黏蟲(chóng)和其他物種絲氨酸蛋白酶氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of serine protease among Mythimna separate and other species based on amino acid sequences

2.4 重組質(zhì)粒pET30a(+)-MsPG的構(gòu)建

通過(guò)PCR擴(kuò)增MsPG基因去除信號(hào)肽序列的編碼區(qū)序列，同時(shí)引入酶切位點(diǎn)EcoRⅠ和Hind Ⅲ，核酸電泳結(jié)果表明，擴(kuò)增到1 547 bp的序列(圖5)。

M.DL2000 DNA 標(biāo)記；1，2.去除信號(hào)肽的MsPG ORF基因的PCR產(chǎn)物；3.重組質(zhì)粒pET30a(+)-MsPG雙酶切產(chǎn)物。

利用T4-DNA連接酶將EcoRⅠ和Hind Ⅲ酶切過(guò)的MsPG基因片段和pET30a(+)進(jìn)行連接，對(duì)構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET30a(+)-MsPG進(jìn)行雙酶切鑒定，核酸電泳結(jié)果表明，酶切產(chǎn)物出現(xiàn)2條帶，其中一條約為1 547 bp(圖5)，與預(yù)期大小相符，測(cè)序結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)重組質(zhì)粒pET30a(+)-MsPG構(gòu)建成功。

2.5 重組質(zhì)粒pET30a(+)-MsPG的表達(dá)

將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒pET30a(+)-MsPG和空載體pET30a(+)轉(zhuǎn)化到E.coliBL21菌株中，在不同溫度下經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，處理樣品進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果表明，pET30a(+)-MsPG誘導(dǎo)組在66.4 ku附近出現(xiàn)一條特異性條帶，與預(yù)期的67.6 ku相符，而對(duì)照組沒(méi)有出現(xiàn)相同的條帶，說(shuō)明融合蛋白MsPG在大腸桿菌中成功表達(dá)，且在不同溫度下的表達(dá)量有差別，25 ℃為最優(yōu)表達(dá)溫度(圖6)。

M.蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1—5.分別為pET30a(+)-MsPG在40，35，30，25，20 ℃下的誘導(dǎo)表達(dá)；6.pET30a(+)的誘導(dǎo)表達(dá)。M.Protein Marker；1—5.Induced expression of pET30a(+)-MsPG at40，35，30，25，20 ℃，respectively；6.Induced expression of pET30a(+).

3 結(jié)論與討論

在昆蟲(chóng)的體液免疫中，絲氨酸蛋白酶參與到其抗菌過(guò)程，通過(guò)促進(jìn)抗菌肽的合成，幫助昆蟲(chóng)抵御外敵。有研究表明，家蠶BmSP142能夠有效地抑制病毒的增殖，幫助機(jī)體抵抗病毒的入侵[12]。在對(duì)煙草天蛾及黃粉蟲(chóng)(Tenebriomolitor)的絲氨酸蛋白酶基因的進(jìn)化分析中發(fā)現(xiàn)，這些基因均有多個(gè)分支，且在機(jī)體的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)中起到類似的作用[13]。一些對(duì)鱗翅目昆蟲(chóng)的研究表明，玉米螟(Ostrinianubilalis)敏感菌株可溶性部分的絲氨酸蛋白酶含量與耐藥菌株相比有顯著差別[14]。絲氨酸蛋白酶參與蘇云金芽孢桿菌(Bt)的原生酶激活和原生酶/毒素降解[15]。因此，對(duì)絲氨酸蛋白酶的研究有利于輔助Bt對(duì)害蟲(chóng)進(jìn)行防治，為研發(fā)新一代殺蟲(chóng)劑奠定基礎(chǔ)。中腸是黏蟲(chóng)消化吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的主要場(chǎng)所，具有大量的微生物和蛋白質(zhì)，絲氨酸蛋白酶是埃及伊蚊[16]、棉鈴蟲(chóng)[17]和蓖麻夜蛾[18]中腸最重要的消化酶。Zhou等[9]對(duì)黏蟲(chóng)胰蛋白酶型絲氨酸蛋白酶和胰凝乳蛋白酶型絲氨酸蛋白酶基因的研究發(fā)現(xiàn)，前者與黏蟲(chóng)的消化和蛻皮密切相關(guān)，后者與有毒物質(zhì)的消化降解密切相關(guān)。然而，目前對(duì)黏蟲(chóng)clip型絲氨酸蛋白酶基因的研究還未見(jiàn)報(bào)道。

本研究利用RT-PCR和RACE技術(shù)成功克隆黏蟲(chóng)的絲氨酸蛋白酶全基因序列，共2 010 bp，命名為MsPG，生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，其開(kāi)放閱讀框?yàn)? 593 bp，編碼530個(gè)氨基酸殘基，這些特征與親緣關(guān)系較近的其他絲氨酸蛋白酶相似。將MsPG氨基酸序列在NCBI-Blast上比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其與其他昆蟲(chóng)氨基酸序列相似性達(dá)到70.00%～91.92%，其中與煙芽夜蛾(登錄號(hào)：PGG78401.1)的一致性最高(91.92%)。對(duì)氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，在N端有信號(hào)肽序列，具有多個(gè)半胱氨酸殘基可以組成多個(gè)二硫鍵，還有保守的GDSGGP序列，可以參與降解底物的過(guò)程。氨基酸序列同源性分析發(fā)現(xiàn)，黏蟲(chóng)MsPG與其他鱗翅目昆蟲(chóng)絲氨酸蛋白酶的氨基酸序列一致性較高，推測(cè)它們行使的功能相似。絲氨酸蛋白酶具有保守性，它們都有類似的一級(jí)結(jié)構(gòu)，主要包括clip結(jié)構(gòu)、sushi結(jié)構(gòu)、wonton結(jié)構(gòu)、frizzle結(jié)構(gòu)等[19]，其中clip結(jié)構(gòu)常具有35～60個(gè)氨基酸殘基，并有6個(gè)半胱氨酸組成的3個(gè)二硫鍵[1]，BmSP95就是clip型絲氨酸蛋白酶，其C端有1個(gè)類似于胰蛋白酶的絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域(tryp_spc)，另外，還有1個(gè)富含脯氨酸的保守序列位于C端和N端之間[20]。本試驗(yàn)中黏蟲(chóng)MsPG的N端也含有clip結(jié)構(gòu)域，推測(cè)其可能屬于clip型絲氨酸蛋白酶。

本研究進(jìn)一步構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET30a(+)-MsPG，并將其導(dǎo)入E.coliBL21感受態(tài)細(xì)胞中，利用IPTG在5個(gè)不同溫度下對(duì)目的蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)其最優(yōu)表達(dá)溫度為25 ℃。黏蟲(chóng)MsPG全長(zhǎng)基因尚屬首次克隆并公布，對(duì)于MsPG的功能仍不清楚，后續(xù)將進(jìn)行融合蛋白純化，深入研究MsPG的功能。

綜上，本研究首次克隆并公布一種黏蟲(chóng)絲氨酸蛋白酶基因，其具有絲氨酸蛋白酶家族保守的功能位點(diǎn)，且在大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)中0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)下的最佳表達(dá)溫度是25 ℃。