宋祥軍，宋自超，沈 嘯，陳 哲，蔣胡艷，侯曼曼，邵 穎，涂 健，祁克宗

(安徽農(nóng)業(yè)大學 獸醫(yī)病理生物學與疫病防控安徽省重點實驗室，安徽省動物性食品質(zhì)量與生物安全工程實驗室，安徽 合肥 230036)

禽致病性大腸桿菌(Avian pathogenicE.coli，APEC)是阻礙全球養(yǎng)禽業(yè)健康發(fā)展的重要的細菌性病原，給養(yǎng)禽業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。APEC致病機理復雜，有多種致病因子介入，分泌系統(tǒng)在APEC引起的疾病中起著重要作用。VI型分泌系統(tǒng)(Type VI secretion systems，T6SS)是一種雙層跨膜分泌系統(tǒng)，參與細菌的不同生物過程，在細菌致病過程中發(fā)揮重要作用，參與病原體與宿主之間的相互作用、競爭、和細菌的適應性等過程[1]。溶血素共調(diào)節(jié)蛋白(Hemolysin-coregulated protein，Hcp)是T6SS復合物中的管道型蛋白。Hcp蛋白具有多種功能，敲除Hcp基因后，致病菌的運動、黏附和定植能力都會受到影響[2-3]。其中Hcp1蛋白可以作為水溶性效應物分泌到菌體外面，影響細胞骨架重排、激活凋亡程序并釋放炎癥因子[4]。

脾臟作為一種機體主要的血液過濾器，它包含B細胞、T細胞、NK細胞、樹突細胞(DC)、巨噬細胞和其他細胞亞群，維持它們的組成比和數(shù)量，對于改善機體的免疫反應至關(guān)重要[5]。尤其是脾臟為動物體內(nèi)最大的淋巴器官，因為禽類的淋巴管和淋巴結(jié)發(fā)育不完善，故脾臟在禽類的免疫反應中占有更重要的地位。脾臟的功能有儲血、過濾病原、淋巴細胞生成和成熟[6]。因此，當脾臟接觸到外來病原體后就會激活自身免疫系統(tǒng)，從過濾的血液中捕獲到抗原，以啟動抗原特異性免疫反應保護自身健康[7]。

鑒于脾臟在禽類免疫體系中的重要地位，更加充分地了解效應蛋白Hcp在APEC感染雛雞脾臟后參與的遺傳調(diào)控，本研究利用獸醫(yī)病理生物學與疫病防控安徽省重點實驗室前期構(gòu)建的缺失株Δhcp2b和回復株Chcp2b感染7日齡羅曼雛雞，檢測脾臟組織載菌量及制作病理組織切片，并進行轉(zhuǎn)錄組學測序分析hcp2b基因缺失后雛雞脾臟mRNA水平的變化，旨在為深入探究APEC的致病機制提供一定的理論基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株和試驗動物 本研究中APEC毒株(AE17)由本實驗室分離保存。缺失株Δhcp2b和回復株Chcp2b由本實驗室構(gòu)建保存。上述菌株在Luria-Bertani(LB)固體培養(yǎng)基(含1.5%瓊脂)或37 ℃的LB肉湯中生長。根據(jù)需要添加氯霉素(30 μg/mL)。從安徽省安禽養(yǎng)殖公司購買了24只1日齡的羅曼雛雞。

1.1.2 主要試劑與儀器 Total RNA Extractor(TRIzol)、M-MuLV Reverse Transcriptas、胰蛋白胨、酵母浸粉、氯化鈉、氯霉素購自上海生工生物有限公司。紫外分光光度儀(WFZ UV-2100)購自上海尤尼柯，熒光定量PCR儀(Step One Plus)購自賽默飛世爾科技，高通量組織研磨儀(SCIENTZ-48)購自寧波新芝。37 ℃恒溫培養(yǎng)箱、搖床、超凈工作臺等儀器由本實驗室提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 雛雞感染 將24只1日齡羅曼雛雞養(yǎng)至7日齡后隨機分成4組，包括3組試驗組和1組對照組，其中試驗組Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中，分別通過腿部肌肉注射1.0×106cfu/mL(1 mL/只)AE17株菌液、Δhcp2b株菌液和Chcp2b株菌液；對照組的6只雛雞通過腿部肌肉注射無菌PBS(1 mL/只)。注射24 h后，對4組雛雞分別進行剖檢并無菌收集脾臟組織。

1.2.2 脾臟HE切片制作及觀察 將采集到的脾臟組織浸泡于4%的多聚甲醛中固定。清洗后經(jīng)不同濃度的無水乙醇脫水，二甲苯透明，然后用液體石蠟將組織包埋。再經(jīng)切片、貼片和烤片后進行HE染色、脫水、透明和封片。石蠟切片制作完成，倒置顯微鏡下查看雛雞脾臟組織病變，并保存圖片。

1.2.3 雛雞脾臟組織載菌量的測定 上述方法中采集的脾臟，在24 h感染后，每組分別抽取3只雛雞采取脾臟進行組織載菌量測定，剖解過程在提前紫外照射0.5 h的超凈工作臺中進行。取出脾臟組織后，稱量組織質(zhì)量0.1 g，加入0.1 mL的無菌PBS，用高通量組織研磨儀進行研磨，后加無菌PBS至1 mL，渦旋混勻，進行倍比稀釋，最后取10 μL懸液采用掛板法進行平板計數(shù)，采用2個梯度進行計數(shù)，每個梯度3個重復，取平均值。

1.2.4 脾臟轉(zhuǎn)錄組學測序及差異表達基因篩選 將上述無菌采集的雛雞脾臟液氮速凍后用干冰保存運輸 ，由杭州聯(lián)川生物測序公司進行轉(zhuǎn)錄組學測序。利用cutadapt排除掉無效reads，并將一系列數(shù)據(jù)進行綜合測評得到有效數(shù)據(jù)(Valid Data)，使用Hisat對預處理后的有效數(shù)據(jù)進行對比。以∣log2Foldchange∣≥1，P≤0.05為標準篩選。

1.2.5 實時熒光聚合酶鏈式反應(Real-time PCR)定量檢測mRNAs 采用Real-time PCR技術(shù)對上述雛雞脾臟組織差異表達基因進行了驗證。用DNase處理從雛雞脾臟組織中提取的總RNA，以去除微量DNA。M-MLV 將1 μg RNA樣品反轉(zhuǎn)錄。利用AccuPower2×GreenstarqPCR主混合物按照20 μL反應體系在Step One Plus實時PCR儀上進行實時PCR，以β-actin作為內(nèi)參基因測定IL22、TNFRSF6B和TNFRSF8的表達水平。引物如表1所示，以2-ΔΔCt法計算樣本間mRNA的相對表達量，t-檢驗對相對表達量統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)表示為“平均數(shù)±標準差”，P<0.05代表差異顯著。

表1 熒光定量PCR的引物序列Tab.1 Primer sequence of Real time quality PCR

1.3 數(shù)據(jù)分析

將篩選的差異基因進行GO和KEGG分析并進行超幾何檢驗。統(tǒng)計GO和KEGG數(shù)據(jù)庫中每個條目定位的差異表達基因數(shù)量。與整個基因組相比，比對出具有顯著富集的差異表達基因GO和KEGG條目。

2 結(jié)果與分析

2.1 缺失株Δhcp2b感染雛雞脾臟組織病理學觀察

取試驗組Ⅰ(APEC感染組)和試驗組Ⅱ(Δhcp2b感染組)脾臟組織制作的石蠟切片觀察，結(jié)果顯示，APEC感染組和Δhcp2b感染組脾臟均出現(xiàn)組織結(jié)構(gòu)疏松，細胞間隙增大，彌散分布紅細胞，淋巴細胞減少(圖1-A、B)。

A.陽性對照組；B.缺失株Δhcp2b試驗組。A.Positive control group；B.Deletion strain Δhcp2b test group.

2.2 組織載菌量試驗結(jié)果

相同劑量的AE17、Δhcp2b 及Chcp2b菌株感染雛雞24 h后對各試驗組雛雞脾臟組織進行載菌量檢測，結(jié)果顯示，AE17、Δhcp2b及Chcp2b感染雛雞脾臟組織載菌量分別是106.15，106.05，106.39cfu/g(圖2)，表明Δhcp2b菌株與野生株AE17相比在脾臟的定植能力沒有明顯差異。

圖2 Δhcp2b脾組織載菌量Fig.2 The infections in spleen of Δhcp2b strain

2.3 差異表達基因的篩選結(jié)果

為了找出APEC與缺失株Δhcp2b對雛雞脾臟組織的差異表達基因，本研究通過比較分析了Δhcp2b感染組和APEC對照組在感染24 h的差異表達水平，以∣log2Foldchange∣≥1，P≤0.05為篩選標準，缺失株Δhcp2b得到515個差異表達基因，其中330個基因下調(diào)表達，185個基因上調(diào)表達(圖3、表2)。

紅色表示差異表達基因上調(diào)；藍色表示差異表達基因下調(diào)；灰色為無變化的差異表達基因。

表2 hcp2b缺失株差異表達基因部分差異表達基因Tab.2 Differentially expressed genes of hcp2b deleted strains partially expressed genes

2.4 Real-time PCR驗證差異表達基因

利用Real-time PCR對IL-22、TNFRSF6B、TNFRSF8基因進行驗證，如圖4所示，IL22、TNFRSF6B、TNFRSF8這3個基因均表達下調(diào)，Real-time PCR檢測結(jié)果與RNA-Seq數(shù)據(jù)表達量變化趨勢一致。

圖4 熒光定量PCR驗證Fig.4 Real-time quality PCR verification

2.5 GO功能分析結(jié)果

GO分析發(fā)現(xiàn)，感染24 h雛雞脾臟差異基因主要集中在細胞外間隙、細胞外基質(zhì)的組織、膜、膜的組成部分、免疫反應、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔和細胞外基質(zhì)等(圖5)。

圖5 hcp2b缺失株顯著富集的GO通路Fig.5 The most significantly enriched GO pathway after hcp2b deletion

2.6 KEGG通路富集分析結(jié)果

KEGG分析發(fā)現(xiàn)，感染24 h時雛雞脾臟差異基因主要匯集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工、細胞因子-細胞因子受體的相互作用、細胞黏附分子(CAMs)等(圖6)。

圖6 hcp2b缺失株差異表達基因KEGG通路富集Fig.6 KEGG functional enrichment of differentially expressed genes of hcp2b deletion strain

3 結(jié)論與討論

溶血素共調(diào)節(jié)蛋白(Hcp)不但是T6SS復合物中的管道型蛋白，也是致病過程中發(fā)揮作用的效應蛋白[8-9]。有研究發(fā)現(xiàn)，霍亂弧菌、檸檬酸桿菌、沙門氏菌、類鼻疽假單胞菌等病原菌的Hcp效應蛋白影響病原菌的黏附入侵、致病性、宿主免疫反應等多種過程[10]，而且不同類型的Hcp蛋白作用也不盡相同。豬腸外致病性大腸桿菌中Hcp2介導細菌競爭，而Hcp1和Hcp3介導細菌與真核細胞的互作[11]。當Hcp蛋白缺失后，副溶血性弧菌對Hela細胞黏附能力降低[12]。本實驗室先前的研究中也發(fā)現(xiàn)，hcp2b影響雛雞氣管黏膜細胞因子-細胞因子受體相互作用通路[13]。為了更好地研究基因hcp2b在APEC致病中的作用，本研究將感染野生株AE17和缺失株Δhcp2b的雛雞脾臟進行組織切片觀察并進行組織載菌量測算，結(jié)果顯示，二者脾臟組織均出現(xiàn)組織結(jié)構(gòu)疏松，細胞間隙增大，彌散分布紅細胞，淋巴細胞減少。且野生株AE17和缺失株Δhcp2b在脾臟組織載菌量中差異不顯著。在黃超等[14]研究報道中，感染大腸桿菌的病死雞顯微觀察脾臟組織間隙增大，脾臟淋巴細胞稀疏，與本試驗結(jié)果相似。而試驗組與對照組并沒有表現(xiàn)出太大差異，推測和組織載菌量差異不大相關(guān)。在彭穎[15]研究中發(fā)現(xiàn)，在豬源性大腸桿菌hcp2缺失株中脾臟的組織載菌量表現(xiàn)為顯著減少。而本研究中脾臟的組織載菌量卻差異不顯著，依據(jù)機體脾臟組織的菌體定植是由血液傳播，推測可能是因為感染動物機體血液中菌體存活量差異造成的。本試驗基于載菌量無顯著變化的基礎上，研究hcp基因缺失對脾臟轉(zhuǎn)錄組學的影響。

將缺失株Δhcp2b與野生株AE17脾臟組織進行RNA-Seq測序分析發(fā)現(xiàn)，差異表達基因主要匯聚在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工、細胞因子與細胞因子受體的相互作用、細胞黏附分子(CAMs)等。其中IL-1R1和IL-1R2表達下調(diào)。已有文獻報道，白細胞介素-1(IL-1)是天然免疫和炎癥的中樞介質(zhì)[16]，在IL-1信號通路的啟動中IL-1R1起著重要作用[17]，白細胞介素-22(IL-22)保護機體并促進炎癥應答的功能。以往研究證實，肺炎克雷伯菌感染小鼠后肺臟和脾臟中IL-22水平下降，細菌載菌量明顯升高[18]。本研究中，缺失株Δhcp2b感染雛雞脾臟導致IL-22的表達下調(diào)，但組織載菌量卻沒有明顯增多。說明IL-22在APEC感染的雛雞脾臟中具體作用有待更深入研究。

GO功能分析顯示，差異表達基因主要富集在膜、膜的組成。KEGG通路富集分析顯示，差異表達基因最顯著富集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工過程。在真核細胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜約占細胞總膜面積的1/2[19]。在機體抵御病原體侵入中需要大量蛋白質(zhì)，但是想要生成某種確定的蛋白質(zhì)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)準確折疊的成功率很低，繼而將引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應。細胞相應的將發(fā)動未折疊蛋白反應(UPR)來減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力[20]。肌醇必需酶1(IRE1)參與UPR信號通路，活化的XBP1(XBP1s)可緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，而XBP1的活化由IRE1完成[21]。當hcp2b基因缺失后，XBP1基因表達下調(diào)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激加重，UPR過程也會受到影響。另外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的質(zhì)量控制系統(tǒng)確保只有正確折疊的蛋白質(zhì)通過識別保留在細胞中和丟棄錯誤折疊或未組裝的蛋白質(zhì)，這一過程被稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解(ERAD)，ERAD系統(tǒng)由多個內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜相關(guān)蛋白和腔蛋白組成的復合體協(xié)同發(fā)揮作用。DERL3是ERAD復合物轉(zhuǎn)換中不可或缺的組成部分[22]。EDEM可以加速糖蛋白ERAD的表達[23]。EDEM3是EDEM的同系物[24]。DERL3基因表達下調(diào)時，ERAD系統(tǒng)復合物轉(zhuǎn)換受到影響，EDEM3基因出現(xiàn)表達下調(diào)時則會減緩ERAD進程。這些因素綜合影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能，進而可能影響免疫機制作用的發(fā)揮。此外，IL-22結(jié)合蛋白亞型有IL-22BPi1、IL-22BPi2和IL-22BPi3，其中IL-22BPi1具有誘導UPR反應的能力，導致GRP78和GRP94內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白水平升高[25]。GRP78和GRP94均為ERAD過程中重要的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白[26-27]。這也表明hcp2b基因可以通過對IL-22基因表達量的調(diào)控間接影響免疫反應的功能。

綜上所述，缺失株Δhcp2b感染雛雞脾臟后，誘導了雛雞脾臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工通路基因的差異表達。觀察到hcp2b參與調(diào)節(jié)IL22、IL1R1、XBP1、EDEM3、DERL3基因的表達，提示hcp2b在APEC感染過程中參與了細菌與宿主的相互作用。研究結(jié)果不僅為明確hcp2b參與APEC感染過程提供證據(jù)，也為研究APEC感染雛雞脾臟的致病機制提供參考。