宋姍姍，張欣婷，王 琦，蘆遠(yuǎn)景，侯春燕，2，3，王冬梅，2，3

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071000；2.省部共建華北作物改良與調(diào)控國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071000；3.河北省植物生理與分子病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071000)

小麥(TriticumaestivumL.)是我國(guó)重要的糧食作物，保證小麥的產(chǎn)量對(duì)于我國(guó)糧食安全具有至關(guān)重要的作用。小麥葉銹病是小麥三大銹病之一，在我國(guó)小麥的主產(chǎn)區(qū)均有過(guò)發(fā)生，其流行年份可使小麥產(chǎn)量減少30%～40%，嚴(yán)重危害糧食安全[1]。因此，研究小麥抵抗葉銹病的分子機(jī)制，為小麥抗葉銹病育種給予分子水平的指導(dǎo)，對(duì)于小麥葉銹病的預(yù)防和治理具有非常重要的意義。

小麥葉銹病是由小麥葉銹菌(Pucciniatriticina)侵染所引起的小麥真菌性病害[2]。在小麥與葉銹菌互作的不親和組合中，葉銹菌吸器母細(xì)胞(Haustorium mother cell，HMC)接觸寄主葉肉細(xì)胞后會(huì)引起葉肉細(xì)胞發(fā)生快速死亡，以阻止葉銹菌對(duì)寄主的進(jìn)一步侵染。這種寄主細(xì)胞快速死亡的現(xiàn)象被稱為過(guò)敏性反應(yīng)(Hypersentive reaction，HR)。HR屬于植物細(xì)胞程序性死亡(Programmed cell death，PCD)現(xiàn)象，是生物體在自身生理病理或受到外界不良環(huán)境刺激時(shí)，按照一定程序結(jié)束細(xì)胞生命的主動(dòng)防衛(wèi)過(guò)程，受到嚴(yán)格調(diào)控[3]。

RanGAP2是一個(gè)GTPase激活蛋白，可激活細(xì)胞內(nèi)非常保守的一類重要小GTPase蛋白R(shí)an，從而參與細(xì)胞內(nèi)一系列重要的生物活動(dòng)，包括有絲分裂過(guò)程中著絲粒的形成、核膜形成等[4-5]。RanGAP2還可以通過(guò)結(jié)合GTP或者GDP而與不同細(xì)胞因子結(jié)合，形成出入細(xì)胞核膜內(nèi)外的不同構(gòu)象，幫助細(xì)胞內(nèi)大分子在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)之間運(yùn)輸和轉(zhuǎn)移。有研究發(fā)現(xiàn)，RanGAP2通過(guò)影響NB-LRR蛋白的胞質(zhì)定位發(fā)揮作用，而NB-LRR蛋白的胞質(zhì)定位對(duì)于HR的誘發(fā)至關(guān)重要。如馬鈴薯NB-LRR免疫受體Rx僅定位于細(xì)胞質(zhì)時(shí)可以發(fā)揮免疫功能，RanGAP2可以影響Rx的核質(zhì)分配，從而決定Rx的功能[6]。馬鈴薯NB-LRR蛋白Gpa2能夠識(shí)別孢囊線蟲(Globoderapallida)分泌蛋白R(shí)BP-1，誘發(fā)HR反應(yīng)，而與Gpa2互作的RanGAP2是Gpa2防御功能所必需的[7]。這些研究說(shuō)明，RanGAP2在植物防御中也發(fā)揮重要作用。

在分析小麥與葉銹菌互作的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)時(shí)發(fā)現(xiàn)，在親和及不親和組合中TaRanGAP2基因的表達(dá)具有明顯差異。在此基礎(chǔ)上，對(duì)TaRanGAP2基因在小麥抵抗葉銹菌侵染中的表達(dá)情況及其抗病分子機(jī)制進(jìn)行了初步研究。證明TaRanGAP2基因在小麥抵抗葉銹菌侵染的寄主過(guò)敏性反應(yīng)發(fā)生具有重要作用。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試小麥品種：小麥近等基因系TcLr26及其輪回親本Tatcher(Tc)。供試菌種：葉銹菌生理小種260。TcLr26和Tc分別與葉銹菌生理小種260組成不親和(TcLr26×260)及親和(Tc×260)組合[8]。供試煙草：本氏煙草。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1TaRanGAP2基因編碼蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析 使用在線軟件PFAM對(duì)TaRanGAP2蛋白保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析。為了研究小麥TaRanGAP2與其他物種中同源蛋白之間的進(jìn)化關(guān)系，通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BlastP同源比對(duì)，利用 MEGA 7軟件對(duì)其氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。

1.2.2 小麥與葉銹菌互作過(guò)程中TaRanGAP2轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá) 當(dāng)TcLr26和Tc小麥幼苗第2片葉生長(zhǎng)至1～2 cm，在其第1片葉上接種葉銹菌生理小種260。在接種后0，8，16，24，48，72 h取樣，取樣質(zhì)量為0.1 g，樣品于液氮速凍后提取 RNA。樣品總RNA的提取方法參照UNlQ-10柱式總RNA 抽提試劑盒說(shuō)明書。以提取的總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄cDNA，具體方法參照TaKaRa公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒。

根據(jù)TaRanGAP2基因序列，使用TB tools軟件設(shè)計(jì)特異性結(jié)合引物(表1)，交由通用生物公司合成。以稀釋后的cDNA為模板，檢測(cè)TaRanGAP2基因在小麥Tc/TcLr26品種分別接種葉銹菌生理小種260后不同時(shí)間點(diǎn)的相對(duì)表達(dá)量，每個(gè)樣品共3個(gè)重復(fù)。采用諾唯贊2×ChamQ Universal SYBR Master Mix試劑盒進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)。以小麥甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(GAPDH)為內(nèi)參基因，利用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.2.3 TaRanGAP2亞細(xì)胞定位 去除TaRanGAP2基因CDS區(qū)終止密碼子，利用DNAMAN軟件設(shè)計(jì)特異性引物(表1)，并添加SalⅠ和SpeⅠ酶切位點(diǎn)。利用PrimeSTAR?GXLDNA Polymerase高保真酶擴(kuò)增TaRanGAP2基因序列。PCR擴(kuò)增的TaRanGAP2基因片段長(zhǎng)度為1 662 bp，與pSuper1300-GFP載體連接，構(gòu)建pSuper1300-TaRanGAP2-GFP載體。利用熱激法將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞GV3101中，保存菌液[9]。

培養(yǎng)包含pSuper1300-TaRanGAP2-GFP載體質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌液，用侵染液離心洗滌，去除YEB培養(yǎng)基。使用分光光度計(jì)調(diào)懸浮菌液的OD600值在0.6～0.8。使用不帶針頭的注射器注射煙草葉片，40～48 h后，取樣，壓片，使用激光共聚焦顯微鏡(CLSM)觀察TaRanGAP2-GFP蛋白綠色熒光的分布狀態(tài)。

1.2.4 利用VIGS技術(shù)探究TaRanGAP2基因功能 以大麥條紋花葉病毒(Barleystripemosaicvirus，BSMV)為載體構(gòu)建TaRanGAP2的VIGS載體BSMV∶TaRanGAP2。將該載體以及河北省植物生理與分子病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存的載體α、β、BSMV∶00、BSMV∶PDS進(jìn)行酶切線性化，并對(duì)線性化產(chǎn)物進(jìn)行純化，以純化產(chǎn)物為模板進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄RNA病毒，將轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于-80 ℃保存。待TcLr26小麥幼苗第2片真葉生長(zhǎng)至1～2 cm時(shí)，對(duì)其第1片真葉進(jìn)行病毒轉(zhuǎn)染，選用各體外轉(zhuǎn)錄的BSMV病毒組成不同的組合和硅藻土(FES)混勻(表2)，摩擦接種至第1片真葉。選用八氫番茄紅素脫氫酶基因(Phytoene desaturase，PDS)為沉默指示基因，當(dāng)該基因被沉默13 d左右時(shí)，小麥第3片葉出現(xiàn)漂白現(xiàn)象，表明轉(zhuǎn)染試驗(yàn)操作成功。此時(shí)，分別在轉(zhuǎn)染BSMV∶00和BSMV∶TaRanGAP2植株的第3片葉上接種葉銹菌生理小種260。在接種后48，96 h取樣，進(jìn)行沉默效率檢測(cè)和Fluorescent Brightener染色，用熒光顯微鏡觀察葉銹菌發(fā)育和HR面積，采集并保存圖像。

表2 VIGS試驗(yàn)體系Tab.2 System of VIGS assay

2 結(jié)果與分析

2.1 TaRanGAP2保守結(jié)構(gòu)域及系統(tǒng)進(jìn)化分析

使用在線軟件PFAM分析發(fā)現(xiàn)，該TaRanGAP2的CDS長(zhǎng)度為1 665 bp，編碼554個(gè)氨基酸。包含一個(gè)WPP 結(jié)構(gòu)域和4個(gè)LRR重復(fù)序列(圖1-A)。

A.保守結(jié)構(gòu)域：綠色為WPP保守結(jié)構(gòu)域；紅色區(qū)域表示LRR亮氨酸重復(fù)序列。B.紅色方框內(nèi)為TaRanGAP2。A.Conserved domain：Green area is the conserved domain of WPP；Red area is the LRR leucine repeat sequence.B.TaRanGAP2 is in the red box.

為了研究TaRanGAP2與其他物種中同源蛋白之間的進(jìn)化關(guān)系，通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BlastP同源比對(duì)，利用 MEGA 7軟件對(duì)其氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，如圖1-B所示，單子葉植物和雙子葉植物分別聚為一類，TaRanGAP2與單子葉植物處于同一分支，而且與大麥同源關(guān)系最近。

2.2 TaRanGAP2在小麥抵抗葉銹菌侵染過(guò)程中的表達(dá)分析

小麥Tc、TcLr26品種在接種葉銹菌生理小種260后，利用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)TaRanGAP2基因在不同時(shí)間表達(dá)量的變化。結(jié)果表明，在不親和組合(TcLr26×260)中，TaRanGAP2基因的表達(dá)量出現(xiàn)顯著上調(diào)，在接種后16 h達(dá)到0 h的7.8倍(圖2)。而在親和組合(Tc×260)中，TaRanGAP2基因的表達(dá)在接種后8 h只是輕微上調(diào)，為0 h的2.1倍。說(shuō)明TcLr26中的TaRanGAP2基因?qū)θ~銹菌的侵染具有更加明顯的應(yīng)激表達(dá)。

RT-qPCR值是3個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，利用SPSS軟件對(duì)其進(jìn)行差異顯著性分析，由同一字母表示的平均值無(wú)顯著差異(P>0.05)。圖4，6同。

2.3 TaRanGAP2定位于細(xì)胞質(zhì)

為進(jìn)一步研究TaRanGAP2在植物細(xì)胞內(nèi)的分布情況，利用煙草瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行TaRanGAP2亞細(xì)胞研究。將包含有pSuper1300-TaRanGAP2-GFP重組載體質(zhì)粒和包含pSuper1300-GFP空白對(duì)照質(zhì)粒的農(nóng)桿菌注射煙草葉片。48 h后通過(guò)CLSM觀察熒光的分布。如圖3所示，TaRanGAP2-GFP熒光分布在細(xì)胞質(zhì)中。

圖3 TaRanGAP2亞細(xì)胞定位Fig.3 Subcellular localization of TaRanGAP2

2.4 TaRanGAP2基因沉默對(duì)小麥抗葉銹菌侵染的影響

待小麥第2片真葉長(zhǎng)為1～2 cm時(shí)，在第1片真葉上接種體外轉(zhuǎn)錄得到的RNA病毒。本試驗(yàn)以BSMV∶PDS為指示組，轉(zhuǎn)染13 d后，觀察發(fā)現(xiàn)PDS沉默植株的第3片葉出現(xiàn)了預(yù)期的漂白現(xiàn)象。同時(shí)轉(zhuǎn)染BSMV∶00、BSMV∶TaRanGAP2病毒植株的第3片葉也均出現(xiàn)了BSMV成功侵染的條紋癥狀，表明病毒轉(zhuǎn)染成功(圖4-A)。

當(dāng)指示組的植株葉片出現(xiàn)漂白現(xiàn)象時(shí)，分別在轉(zhuǎn)染BSMV∶00和BSMV∶TaRanGAP2植株的第3片葉上接種葉銹菌生理小種260，在接種48，96 h后分別取樣，利用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)該植株TaRanGAP2基因的沉默效率(圖4-B)，以轉(zhuǎn)染BSMV∶00的植株作為對(duì)照組，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染BSMV∶TaRanGAP2植株中TaRanGAP2基因相對(duì)表達(dá)量顯著下降，表明其被有效沉默。

A.轉(zhuǎn)染病毒后13 d葉片表型觀察；B.利用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)TaRanGAP2基因沉默效率。A.Observation of leaf phenotype 13 days after virus transfection；B.The detection of TaRanGAP2 gene silencing efficiency by RT-qPCR.

同時(shí)將48，96 h取樣的部分小麥葉片樣品進(jìn)行Fluorescent Brightener染色處理(圖5)，觀察沉默植株葉片的單侵染點(diǎn)吸器母細(xì)胞數(shù)量及HR面積。

隨機(jī)統(tǒng)計(jì)分析了50個(gè)單侵染點(diǎn)的HMC數(shù)量(圖6-A)和HR面積(圖6-B)，從統(tǒng)計(jì)結(jié)果可以看出，相比對(duì)照組植株，TaRanGAP2基因沉默植株的HR面積顯著增大，其HMC數(shù)量也顯著增多；由于小麥葉肉細(xì)胞通過(guò)形成HR來(lái)限制葉銹菌的發(fā)育，因此，推測(cè)沉默TaRanGAP2后，HR發(fā)生進(jìn)程減慢，小麥抗性減弱，無(wú)法阻止葉銹菌的生長(zhǎng)，進(jìn)而使HMC數(shù)量增加，導(dǎo)致誘發(fā)更為嚴(yán)重的HR，使得HR面積有所增加。

紫外光激發(fā)觀察HMC個(gè)數(shù)；藍(lán)光激發(fā)觀察HR面積。Number of HMC observed by ultraviolet excitation；HR area observed by blue-light excitation.

A.接菌后單侵染點(diǎn)的HMC數(shù)量統(tǒng)計(jì)；B.接菌后單侵染點(diǎn)的HR面積統(tǒng)計(jì)。A.Statistics of the number of HMCs at a single infection site after inoculation; B.Statistics of HR area of single infection site after inoculation.

3 結(jié)論與討論

本研究通過(guò)分析小麥與葉銹菌互作的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，觀察到在親和及不親和組合中TaRanGAP2基因的表達(dá)量具有顯著差異。借助RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在不親和組合中TaRanGAP2被顯著誘導(dǎo)表達(dá)，提示在不親和組合中TaRanGAP2可能與HR的發(fā)生相關(guān)。因此，利用VIGS技術(shù)沉默TcLr26植株的TaRanGAP2基因，在接種葉銹菌后與對(duì)照組相比，沉默TaRanGAP2基因的植株葉片單侵染點(diǎn)HR面積顯著增大，HMC數(shù)量顯著增多。

由于小麥葉肉細(xì)胞通過(guò)形成HR來(lái)限制葉銹菌的發(fā)育，因此，推測(cè)沉默TaRanGAP2后，HR發(fā)生進(jìn)程減慢，小麥抗性減弱，無(wú)法阻止葉銹菌的生長(zhǎng)，進(jìn)而HMC數(shù)量增加，增加的HMC接觸到寄主細(xì)胞又進(jìn)一步引起死亡，導(dǎo)致誘發(fā)更為嚴(yán)重的HR，使得HR面積增大。以上結(jié)果表明，TaRanGAP2在抵抗葉銹菌侵染時(shí)發(fā)揮正調(diào)控作用。

研究表明，植物NB-LRR蛋白的亞細(xì)胞定位與抗性激活密切相關(guān)，NB-LRR類蛋白的亞細(xì)胞排布狀態(tài)，可能決定其不同的作用，如啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄再編程或啟動(dòng)細(xì)胞死亡信號(hào)。許多NB-LRR受體包括擬南芥RPS4、SNC1、煙草N、馬鈴薯Rx、大麥MLA10以及水稻Pb1既定位于細(xì)胞質(zhì)也定位于細(xì)胞核[10]。大麥MLA10的CC結(jié)構(gòu)域存在于細(xì)胞質(zhì)時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的活性可進(jìn)一步得到增強(qiáng)，導(dǎo)致HR的發(fā)生[11]，但當(dāng)其識(shí)別病原微生物(如白粉病菌效應(yīng)子A10)被激活時(shí)，在細(xì)胞核中的積累量明顯增加，參與調(diào)控防御相關(guān)基因的表達(dá)[12]。煙草TIR-NB-LRR蛋白N，其自身的LRR區(qū)域可以與細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子互作，進(jìn)而激活對(duì)煙草花葉病毒的抗性[13]，當(dāng)其結(jié)合核輸出信號(hào)時(shí)，N在細(xì)胞核中的積累消失，檢測(cè)到其對(duì)煙草花葉病毒的抗性也隨之消失[14-15]。馬鈴薯Rx同樣為核質(zhì)分布，當(dāng)馬鈴薯X病毒外殼蛋白(PVX-CP)定位于細(xì)胞質(zhì)時(shí)，Rx發(fā)生激活并引起強(qiáng)烈的HR。RanGAP2可以影響Rx的核質(zhì)分布狀態(tài)[16]，當(dāng)Rx與RanGAP2共表達(dá)時(shí)，它們均勻分布在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)[17-18]。有研究指出，借助基因沉默手段抑制馬鈴薯RanGAP2的表達(dá)，會(huì)嚴(yán)重削弱Rx蛋白對(duì)PVX的抗性反應(yīng)[19-20]。本研究將含有pSuper1300-TaRanGAP2-GFP載體的農(nóng)桿菌瞬時(shí)轉(zhuǎn)化本氏煙草葉片，利用激光共聚焦熒光顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)TaRanGAP2蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)中。推測(cè)TaRanGAP2可能在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)發(fā)揮與馬鈴薯RanGAP2類似的作用，還需要進(jìn)一步篩選TaRanGAP2的互作蛋白進(jìn)行深入研究。