薛海波，張潔菡，金思洋，彭英云，楊治風(fēng)，陳義勇

（1.常熟理工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，江蘇 常熟 215500；2.江蘇梁豐食品集團(tuán)有限公司，江蘇 張家港 215623；3.張家港市畜牧獸醫(yī)站，江蘇 張家港 215699）

晚期糖基化末端產(chǎn)物（advanced glycation end-products，AGEs）是在非酶促條件下，蛋白質(zhì)中游離的氨基與還原糖的羰基經(jīng)過縮合、重排、降解、氧化等復(fù)雜反應(yīng)生成的[1].越來越多的證據(jù)表明AGEs能夠?qū)е略S多疾病如糖尿病、阿爾茨海默病、腎功能障礙、心血管疾病等[2-3].研究表明AGEs一方面來源于食品熱加工過程，另一方面來源于人體環(huán)境，并且可以在人體中長期積累、存在，從而對(duì)人體健康造成影響.因此，尋找能夠有效抑制AGEs形成的物質(zhì)顯得尤為重要.

UHT奶常溫貯存時(shí)間長（6個(gè)月），方便銷售，占據(jù)液體奶市場主導(dǎo)地位[4].然而UHT奶加工和貯藏過程中會(huì)產(chǎn)生對(duì)人體有害的產(chǎn)物AGEs.如何降低UHT奶加工過程中產(chǎn)生AGEs是急需解決的問題.

黃酮作為烏飯樹葉中重要的一類具有功能活性的化合物，目前的研究主要集中在其提取[5-7]、分離及結(jié)構(gòu)[8]、生物活性如抗氧化活性[9]、降血糖[10]等方面，但是關(guān)于烏飯樹葉黃酮抑制晚期糖基化末端產(chǎn)物的研究未見報(bào)道.因此本文以UHT奶為研究對(duì)象，探究烏飯樹葉黃酮對(duì)UHT奶加工過程中AGEs的抑制作用，旨在為烏飯樹葉黃酮在UHT奶加工和貯藏中的應(yīng)用提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

烏飯樹葉黃酮（本實(shí)驗(yàn)室提取純化）；原料乳（江蘇梁豐食品集團(tuán)有限公司提供）；甲醇、磷酸氫二鈉、Nα-乙?；?L-賴氨酸、硼酸鈉、硼酸、硼氫化鈉、三氯乙酸（均為分析純）（上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；蔗糖脂肪酸酯、單甘油脂肪酸酯（廣州立勝貿(mào)易有限公司）.

1.2 儀器與設(shè)備

RT-6000酶標(biāo)儀（深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司）；AH-BASIC均質(zhì)機(jī)（安拓思納米技術(shù)蘇州有限公司）；TG16-WS高速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；Agilent LC-MS（美國安捷倫公司）；HS-150恒溫恒濕培養(yǎng)箱（常州市金壇友聯(lián)儀器研究所）；超高溫瞬時(shí)殺菌系統(tǒng)（上海沃迪智能裝備股份有限公司）；pH計(jì)（瑞士METTLER TOLEDO公司）.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 調(diào)制乳的制備流程

1.3.2 熒光性AGEs含量的測定

根據(jù)文獻(xiàn)[11]的方法進(jìn)行熒光性AGEs含量的測定.將2 mL UHT奶和4 mL甲醇混勻，在-80 ℃條件下保存1 h后離心（13 000 r/min）30 min.取0.3 mL上清液，在λex/λem=340 nm/465 nm波長處測定熒光值.以磷酸鹽緩沖溶液作為對(duì)照，每組樣品重復(fù)3次.

1.3.3 羧甲基賴氨酸（CML）含量的測定

CML是一種常被用作食品中AGEs的標(biāo)志物[12].參考Assar等人[13]方法并做適當(dāng)?shù)男薷倪M(jìn)行CML的測定.取100 mL UHT奶和0.5 mol/L的硼酸鈉緩沖溶液（pH9.2）混合，最終硼酸鈉緩沖溶液濃度為0.2 mol/L.加入1 mol/L的硼氫化鈉溶液（用NaOH配制）混合均勻，硼氫化鈉溶液最終濃度為0.1 mol/L.混合后的樣品在4 ℃條件下還原10 h.還原結(jié)束后向反應(yīng)樣品中加入三氯乙酸（60%）使其最終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%.靜止30 min后沉淀蛋白質(zhì)，再在4 ℃條件下離心（15 000 r/min，10 min）收集沉淀，并向沉淀中加入鹽酸（6 mol/L）1 mL，然后在110 ℃條件下水解24 h.水解完成后用氮?dú)獯蹈傻玫礁稍锏牡鞍踪|(zhì)水解物.將蛋白水解物和3 mL水充分混合直至全部溶解.根據(jù)文獻(xiàn)[14]的方法采用PCX固相萃取柱進(jìn)行除雜，具體步驟如下：依次用3 mL甲醇和3 mL純凈水洗脫P(yáng)CX固相萃取柱，對(duì)其進(jìn)行預(yù)活化.活化完成后，取復(fù)溶蛋白水解物樣品溶液通過PCX固相萃取柱，依次用3 mL甲醇和3 mL水進(jìn)行洗脫.用5 mL甲醇對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，用氮?dú)鈱⑵浯蹈?將樣品重新溶于3 mL水中，用0.40 μm濾膜過濾，利用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測定樣品中CML的含量，所有樣品均做3次平行試驗(yàn).

1.3.4 UHT奶加工過程中烏飯樹葉黃酮對(duì)熒光性AGEs形成的影響

原料奶經(jīng)過檢驗(yàn)后過濾、冷卻、貯存，加入0.3%的復(fù)配穩(wěn)定劑（蔗糖脂肪酸酯和單甘油脂肪酸酯）和5%的白砂糖，充分混勻后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為2%，4%，6%，8%和10%的烏飯樹葉黃酮.過濾均質(zhì)后在137 ℃條件下進(jìn)行UHT殺菌，殺菌時(shí)間為4 s.按照1.3.2節(jié)的方法測定UHT奶樣品中熒光性AGEs的含量.以磷酸鹽緩沖溶液代替烏飯樹葉黃酮作為對(duì)照組，每組樣品重復(fù)3次.

1.3.5 UHT奶加工過程中烏飯樹葉黃酮對(duì)CML形成的影響

原料奶按照1.3.4節(jié)的方法處理后按照1.3.3節(jié)的方法測定UHT奶樣品中CML含量，每組樣品重復(fù)3次.

1.3.6 不同貯藏溫度條件下烏飯樹葉黃酮對(duì)UHT奶中熒光性AGEs形成和CML含量的影響

原料奶按照1.3.4節(jié)的方法處理后取出冷卻至室溫，將UHT奶分別貯藏在25 ℃和37 ℃的培養(yǎng)箱中.15 d后取出樣品，按1.3.2節(jié)的方法測定樣品中的AGEs含量.以磷酸鹽緩沖溶液代替烏飯樹葉黃酮作為對(duì)照組，每組樣品重復(fù)3次.按照1.3.3節(jié)的方法測定樣品中CML含量，每組樣品重復(fù)3次.

1.3.7 不同貯藏時(shí)間條件下烏飯樹葉黃酮對(duì)UHT奶中熒光性AGEs形成和CML含量的影響

原料奶按照1.3.4節(jié)的方法處理后取出冷卻至室溫.將UHT奶貯藏在25 ℃培養(yǎng)箱中，分別于0，10，15，30，60 d時(shí)取樣，按1.3.2節(jié)的方法測定樣品中的AGEs含量.以磷酸鹽緩沖溶液代替烏飯樹葉黃酮作為對(duì)照組，每組樣品重復(fù)3次.按照1.3.3節(jié)的方法測定樣品中CML含量，每組樣品重復(fù)3次.

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

每組數(shù)據(jù)進(jìn)行3次平行試驗(yàn)取平均值，以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示.采用Origin8.0軟件作圖，SPSS20 軟件處理數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和顯著性分析（P＜0.05表示存在顯著性差異）.

2 結(jié)果與討論

2.1 UHT奶加工過程中烏飯樹葉黃酮對(duì)熒光性AGEs形成的影響

UHT奶加工過程中烏飯樹葉黃酮對(duì)熒光性AGEs形成的影響結(jié)果見圖1.從圖1可以看出，與對(duì)照組相比，當(dāng)烏飯樹葉黃酮添加量大于2%時(shí)，相對(duì)熒光值隨著添加量的增加而下降，說明烏飯樹葉黃酮在UHT奶加工過程中具有明顯的抑制AGEs生成的作用（P＜0.05），同時(shí)確定合適的烏飯樹葉黃酮添加量為8%.楊生輝等人[15]的研究則發(fā)現(xiàn)玉米須黃酮具有明顯抑制AGEs生成的作用，抑制能力隨著濃度的增加而提高.

圖1 UHT奶加工過程中烏飯樹葉黃酮對(duì)熒光性AGEs形成的影響

2.2 UHT奶加工過程中烏飯樹葉黃酮對(duì)CML形成的影響

UHT奶加工過程中烏飯樹葉黃酮對(duì)CML形成的影響見圖2.從圖2可以看出，與對(duì)照組相比，隨著烏飯樹葉黃酮添加量的增加，CML的濃度逐步下降，烏飯樹葉黃酮在UHT奶加工過程中具有明顯的抑制CML生成的作用（P＜0.05）.孫濤等人[16]則發(fā)現(xiàn)竹葉黃酮具有抑制糖基化反應(yīng)進(jìn)程，抑制CML生成的作用.原因是竹葉黃酮能夠與糖基化反應(yīng)過程中產(chǎn)生的自由基相結(jié)合從而起到抑制糖基化反應(yīng)進(jìn)程的作用.

圖2 UHT奶加工過程中烏飯樹葉黃酮對(duì)CML形成的影響

2.3 不同貯藏溫度條件下烏飯樹葉黃酮對(duì)UHT奶中熒光性AGEs形成和CML含量的影響

不同貯藏溫度條件下烏飯樹葉黃酮對(duì)UHT奶中熒光性AGEs形成的影響見圖3.由圖3可以看出，與對(duì)照組相比，在同一貯藏溫度條件下，UHT奶熒光性AGEs形成量隨著烏飯樹葉黃酮添加量的增大而下降，差異顯著（P＜0.05）；烏飯樹葉黃酮添加量大于8%時(shí)，隨著添加量的增大，UHT奶熒光性AGEs形成量差異不顯著（P>0.05）.在同一烏飯樹葉黃酮濃度條件下，UHT奶中熒光性AGEs形成量隨著貯藏溫度的升高而增大；烏飯樹葉黃酮濃度低于8%時(shí)，差異顯著（P＜0.05）.這可能是由于UHT奶在貯藏過程中，溫度越高越會(huì)促進(jìn)糖類物質(zhì)發(fā)生羥醛縮合并與脂肪發(fā)生氧化，產(chǎn)生更多的1,2-二羰基化合物，進(jìn)而導(dǎo)致更多AGEs的形成[17].不同貯藏溫度條件下烏飯樹葉黃酮對(duì)UHT奶中CML含量的影響見圖4.由圖4可以看出，與對(duì)照組相比，在不同貯藏溫度條件下，烏飯樹葉黃酮添加量不大于4%時(shí)，UHT奶CML含量隨著烏飯樹葉黃酮添加量的增大下降不顯著（P>0.05）；烏飯樹葉黃酮添加量大于4%時(shí)，隨著添加量的增大，UHT奶中CML含量差異顯著（P＜0.05）.在同一烏飯樹葉黃酮濃度條件下，UHT奶中CML含量隨著貯藏溫度的升高而增大.因此低溫貯存以及添加8%的烏飯樹葉黃酮更有利于降低蛋白糖基化的進(jìn)程，減少AGEs的形成和CML的含量，提高產(chǎn)品的安全性.

圖3 不同貯藏溫度條件下烏飯樹葉黃酮對(duì)UHT奶中熒光性AGEs形成的影響

圖4 不同貯藏溫度條件下烏飯樹葉黃酮對(duì)UHT奶中CML含量的影響

2.4 不同貯藏時(shí)間條件下烏飯樹葉黃酮對(duì)UHT奶中熒光性AGEs的形成和CML含量的影響

不同貯藏時(shí)間條件下烏飯樹葉黃酮對(duì)UHT奶中熒光性AGEs形成的影響見圖5.由圖5可以看出，與對(duì)照組相比，在同一貯藏時(shí)間條件下，UHT奶中熒光性AGEs的形成量隨著烏飯樹葉黃酮添加量的增大而下降，差異顯著（P＜0.05）；烏飯樹葉黃酮添加量大于6%時(shí)，隨著添加量的增大，UHT奶中熒光性AGEs的形成量差異不顯著（P>0.05）.在同一烏飯樹葉黃酮濃度條件下，UHT奶中熒光性AGEs的形成量隨著貯藏時(shí)間的延長而增大；貯藏時(shí)間不超過15 d時(shí)，差異不顯著（P>0.05），貯藏時(shí)間超過15 d時(shí)，差異顯著（P＜0.05）.這可能是由于UHT奶在貯藏過程中，時(shí)間越長越會(huì)促進(jìn)糖類物質(zhì)發(fā)生羥醛縮合并與脂肪發(fā)生氧化，導(dǎo)致更多AGEs的形成[18].不同貯藏時(shí)間條件下烏飯樹葉黃酮對(duì)UHT奶中CML含量的影響見圖6.由圖6可以看出，與對(duì)照組相比，在不同貯藏時(shí)間條件下，隨著烏飯樹葉黃酮添加量的增大，UHT奶中CML含量逐步下降（P＜0.05）；在同一烏飯樹葉黃酮濃度條件下，UHT奶中CML含量隨著貯藏時(shí)間的延長而增大.因此，UHT奶的貯藏時(shí)間不宜超過15 d，低溫貯存以及添加烏飯樹葉黃酮有利于減少CML的含量.

圖5 不同貯藏時(shí)間條件下烏飯樹葉黃酮對(duì)UHT奶中熒光性AGEs形成的影響

圖6 不同貯藏時(shí)間條件下烏飯樹葉黃酮對(duì)UHT奶中CML含量的影響

3 結(jié)論

本文以UHT奶為研究對(duì)象，以烏飯樹葉黃酮抑制UHT奶加工和貯藏過程中晚期糖基化末端產(chǎn)物為核心，闡明了烏飯樹葉黃酮抑制UHT奶中AGEs和CML產(chǎn)生的效果.結(jié)果表明：在UHT奶加工過程中，烏飯樹葉黃酮具有明顯的抑制AGEs和CML生成的作用，并且隨著烏飯樹葉黃酮添加量的增大，抑制作用逐步增加.在UHT奶貯藏過程中，低溫貯存以及適當(dāng)增加烏飯樹葉黃酮的添加量更有利于降低蛋白糖基化的進(jìn)程，減少AGEs的形成和CML的含量，提高產(chǎn)品的安全性.烏飯樹葉黃酮能夠在UHT奶生產(chǎn)和貯藏過程中有效調(diào)控有害物質(zhì)的產(chǎn)生，具有較好的抗糖化作用，在乳制品的生產(chǎn)過程中作為一種天然有效的AGEs抑制劑具有廣闊的應(yīng)用前景，其抑制機(jī)理有待進(jìn)一步深入研究.