陳偉意 史聰穎 李佩瑤 馬天寶 顏紅金 韋燕 魏偉

長久以來，臍帶血被認(rèn)為是生物廢物直接丟棄，隨著科學(xué)研究的不斷進(jìn)步，自1988年法國開展了世界上首例同胞臍帶血移植治療范可尼貧血以后，人們才漸漸意識到臍帶血的重要性。除了進(jìn)行造血干細(xì)胞移植治療血液類疾病，重建造血、免疫系統(tǒng)，臍帶血也被廣泛應(yīng)用于遺傳病、代謝病、免疫病及再生醫(yī)學(xué)（尤其是神經(jīng)系統(tǒng)損傷）的臨床治療和研究[1]。目前，全世界臍帶血造血干細(xì)胞保存量已超過600 000份，臨床應(yīng)用量已超過30 000例[2]。 臍血中含有比骨髓中造血干細(xì)胞更豐富更原始的、具有擴(kuò)增能力的造血干細(xì)胞,其優(yōu)點(diǎn)是來源廣泛、采集簡單,目前是繼骨髓和外周血后的第三大造血干細(xì)胞來源[3]。但臍帶血采集難免會有微生物污染的風(fēng)險(xiǎn)，受污染的血液如果進(jìn)入到患者體內(nèi)將會產(chǎn)生嚴(yán)重的后果，因此微生物檢測為陰性是臍帶血造血干細(xì)胞符合臨床應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的條件之一[4]。 在不同分娩方式里，順產(chǎn)后采集的臍帶血，其受污染的可能性是最高的[5-6]。因此，嚴(yán)格規(guī)范產(chǎn)后臍帶血采集消毒操作方式，是降低臍帶血采集時的微生物污染率的最重要一環(huán)。本研究利用單盲隨機(jī)對照的方式研究臍帶消毒方式對臍帶血污染率和臍帶血質(zhì)量的影響，為降低臍帶血污染率提供了一種新的、可行性強(qiáng)的臨床臍帶血采集方案。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2019年5—12月在廣州市南方醫(yī)科大學(xué)附屬何賢紀(jì)念醫(yī)院產(chǎn)科分娩的400例孕婦。采用單盲隨機(jī)對照的方法，把納入的孕婦隨機(jī)分成試驗(yàn)組與對照組，各200例，納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）孕產(chǎn)婦年齡18～45歲；（2）簽署臍帶血自存知情同意書；（3）孕產(chǎn)婦的信息記錄完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）產(chǎn)前經(jīng)醫(yī)生評估后不適合術(shù)中采集臍帶血的高危孕產(chǎn)婦；（2）已知造成宮內(nèi)感染的孕婦。剔除標(biāo)準(zhǔn)：（1）采集的臍血中有凝塊或異物；（2）臍帶血采集信息表填寫不完整的臍帶血；（3）穿刺2次及以上采集到的臍帶血；（4）含有臍血的采血袋在檢測前破裂或有臍血漏出；（5）實(shí)驗(yàn)室處理臍血過程中導(dǎo)致污染的臍血。該試驗(yàn)的實(shí)施已獲醫(yī)院倫理委員會同意。所有病例資料采集均獲得孕婦同意，并簽署試驗(yàn)知情同意書。記錄整理產(chǎn)婦的年齡，分娩結(jié)局及新生兒體質(zhì)量作為一般資料，兩組產(chǎn)婦的年齡、分娩結(jié)局和新生兒體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性，見表1。

表1 兩組產(chǎn)婦及新生兒一般資料比較

1.2 方法

試驗(yàn)組：陰道分娩時，應(yīng)先在采血臺上鋪一張無菌巾，將臍帶放在無菌巾上，然后開始消毒采集臍帶血。用含碘伏的紗布或有尾紗條，包裹消毒整條臍帶1次，選擇胎盤斷端的臍帶4～5 cm位置作為穿刺部位，對穿刺部位再消毒2次，由臍帶胎盤斷端向胎盤方向擦拭穿刺點(diǎn)，不能來回擦拭（圖1）。

圖1 深度臍帶消毒方案步驟

對照組：使用常規(guī)消毒方案。陰道分娩時，使用75%的酒精棉球?qū)δ殠Т┐滩课幌?～2次，由臍帶胎盤斷端向胎盤方向擦拭穿刺點(diǎn)，不能來回擦拭。

臍帶血采集操作參照《臍帶血造血干細(xì)胞庫技術(shù)規(guī)范》[7]。穿刺操作在已經(jīng)消毒的穿刺部位上穿刺采集，選擇臍靜脈相對平直，充盈處作為穿刺點(diǎn)。用無菌紗布固定防滑脫，進(jìn)行臍靜脈穿刺時，采血針尖斜面向下或偏向側(cè)面，如果臍靜脈相對平直，見血后針頭沿血管壁順行1～2 cm。讓臍帶血通過重力作用流入一次性采血袋內(nèi)，同時輕輕搖晃采血袋，以便血液與采血袋內(nèi)的抗凝劑充分混勻。臍帶血采集后，立即保存在0～4℃冰箱中，待廣東省臍帶血造血干細(xì)胞庫（以下簡稱廣東省臍血庫）工作人員統(tǒng)一收集并裝入血液運(yùn)輸箱中（溫度保持在4～25℃），自臍帶血采集后36 h內(nèi)運(yùn)輸至廣東省臍血庫。廣東省臍血庫在采集后48 h內(nèi)完成臍血的制備，通過程序降溫至-80 ℃后放置于液氮中保存。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 單個核細(xì)胞計(jì)數(shù) 臍帶血到達(dá)廣東省臍血庫后，每份臍帶血由兩人復(fù)核信息，熱合去除采血針及多余管路后，血袋稱重并計(jì)算臍帶血量。每份臍帶血編碼其唯一的編號，然后對血袋表面進(jìn)行消毒。臍帶血取1 mL全血血樣，在五分類血球計(jì)數(shù)儀（日本，Sysmex，XE-5000）機(jī)器下對有核細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，測算總有核細(xì)胞數(shù)。臍帶血經(jīng)離心制備后，從濃縮后臍血樣本抽取約0.1 mL加入RPMI-1640培養(yǎng)液制備成稀釋約10倍的細(xì)胞懸液，充分混勻細(xì)胞懸液后取出200 μL于五分類血球計(jì)數(shù)儀下計(jì)算凍前有核細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.3.2 細(xì)菌污染陽性率 在萬級無菌操作室內(nèi)，臍帶血單個核細(xì)胞制備完后，將臍血分離出臍血血漿聯(lián)袋，抽取臍血血漿10 mL分別接種至需氧瓶和厭氧瓶，采用全自動細(xì)菌培養(yǎng)儀培養(yǎng)7 d，檢測是否有細(xì)菌污染。

1.3.3 CD34+細(xì)胞含量及有核細(xì)胞活性分析 采用流式細(xì)胞術(shù)對制備后獲得的單個核細(xì)胞進(jìn)行測定。流式細(xì)胞儀（FACSCalibur，BD公司）檢測已標(biāo)記好的樣本，根據(jù)ISHAGE標(biāo)準(zhǔn)[7]，利用白細(xì)胞共同抗原-45（CD45）、白細(xì)胞共同抗原-34（CD34）單克隆抗體（CD45是有核細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，CD34是造血干祖細(xì)胞的特異性標(biāo)志物）來對臍帶血進(jìn)行檢測。根據(jù)造血干/祖細(xì)胞的4個特征[CD34陽性、CD45弱陽性、低前行散射光（SSC）、側(cè)向散射光（FSC）]圈選出造血干/祖細(xì)胞占有核細(xì)胞的含量，即得到CD34+細(xì)胞含量。根據(jù)細(xì)胞染色劑7-氨基放線菌素D（7-AAD）可使死細(xì)胞染色的原理來檢測臍帶血中活細(xì)胞占有核細(xì)胞的含量，即有核細(xì)胞活性。

1.3.4 CFU-GM集落細(xì)胞培養(yǎng)分析 臍帶血樣本抽取約0.1 mL加入RPMI-1640培養(yǎng)液制備成稀釋約10倍的細(xì)胞懸液，根據(jù)標(biāo)本細(xì)胞懸液濃度及最終培養(yǎng)體系為3.3 mL，結(jié)合計(jì)算所需加入的甲基纖維素培養(yǎng)基及細(xì)胞懸液的各自體積，制成有核細(xì)胞終濃度定量為5×104個/mL的培養(yǎng)體系。將培養(yǎng)板放入37℃、5%CO2、濕度＞95%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d。培養(yǎng)結(jié)束取出培養(yǎng)板在倒置顯微鏡下觀察，統(tǒng)計(jì)每份臍帶血培養(yǎng)的3個孔的集落數(shù)，取其均值作為該份臍帶血的粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞集落形成單位（CFU-GM）的計(jì)數(shù)結(jié)果。＞40個細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)確認(rèn)為1個集落，只計(jì)CFU-GM、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞系集落生成單位（CFU-GEMM）、單核系集落形成單位（CFU-M）集落，不計(jì)紅細(xì)胞爆式集落形成單位（BFU-E）集落。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)的數(shù)據(jù)分組在進(jìn)行數(shù)據(jù)分析前未對數(shù)據(jù)分析處理人員揭盲，數(shù)據(jù)分析完成后由項(xiàng)目負(fù)責(zé)人對數(shù)據(jù)分組進(jìn)行揭盲。數(shù)據(jù)分析采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 18.0處理。計(jì)量數(shù)據(jù)的檢測結(jié)果以（±s）表示，兩組間比較行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)（n）和百分率（%）表示，予以χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

試驗(yàn)組臍帶血細(xì)菌污染率為1.0%（2/200），低于對照組的臍帶血細(xì)菌污染率2.5%（5/200）。試驗(yàn)組與對照組的臍帶血凍前有核細(xì)胞計(jì)數(shù)、CD34+細(xì)胞含量、凍前有核細(xì)胞活性和CFUGM細(xì)胞計(jì)數(shù)等比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2 兩組對臍帶血質(zhì)量的影響指標(biāo)對比（ x- ±s）

3 討論

臍帶血造血干細(xì)胞在臨床中主要用于治療血液病及血液腫瘤等[8]，現(xiàn)也已有開展多項(xiàng)治療神經(jīng)系統(tǒng)損傷疾病的臨床試驗(yàn)，如腦癱、自閉癥等[9-11]。臍帶血的臨床應(yīng)用都需要把臍帶血造血干細(xì)胞輸注到患者血液中，一旦病原生物通過污染的血液入侵人體，會導(dǎo)致一系列不良反應(yīng)，嚴(yán)重者甚至?xí)＜盎颊咝悦?鑒于血液細(xì)菌污染的嚴(yán)重性，所有入庫的臍帶血都必須檢測為無菌的。臍血污染途徑存在3種可能：（1）產(chǎn)房采集過程中污染；（2）運(yùn)輸途徑中污染；（3）實(shí)驗(yàn)室處理過程中污染[6]。分離和采集是造成污染的主要因素，臍帶血細(xì)菌污染90%以上是由采集環(huán)節(jié)造成的[4]，因此臍帶消毒的方式對臍帶血采集的污染率至關(guān)重要。

本研究試驗(yàn)組采用了含碘伏的紗布或有尾紗條作為消毒工具，相比于常規(guī)臍帶消毒的用酒精棉球，可以更好地對臍帶進(jìn)行包裹，并可以全面地包裹抹擦臍帶已達(dá)到更為深度的消毒效果。對采集臍帶血的消毒步驟提出了質(zhì)量可控的標(biāo)準(zhǔn)化操作流程：包裹消毒整條臍帶1次，選擇胎盤斷端的臍帶4～5 cm位置作為穿刺部位，對穿刺部位再消毒2次，可以進(jìn)一步可控地防治臍血污染的發(fā)生，斷絕污染途徑。目前國內(nèi)外并未有對臍帶血消毒方式是否會對臍帶血的污染率及臍帶血質(zhì)量產(chǎn)生影響的研究，本研究填補(bǔ)了這一空白。研究納入的兩組產(chǎn)婦年齡、新生兒體質(zhì)量的值沒有顯著差異，減少了其對臍帶血凍前有核細(xì)胞計(jì)數(shù)、CD34+細(xì)胞含量及CFU-GM的偏倚。同時納入的產(chǎn)婦陰道產(chǎn)及剖腹產(chǎn)的數(shù)量接近，也減少了不同分娩結(jié)局對臍帶血污染率不同的偏倚。研究結(jié)果表明，試驗(yàn)組的污染率為1.0%，凍前有核細(xì)胞計(jì)數(shù)（7.43±4.13）×108個，凍前有核細(xì)胞活性（96.50±2.41）%，CD34+細(xì)胞含量（0.30±0.15）%，CFU-GM（102.07±36.89）/105個細(xì)胞數(shù)。對比對照組，試驗(yàn)組細(xì)菌/霉菌的污染率下降1.5%，而與對照組凍前有核細(xì)胞數(shù)、CD34+細(xì)胞含量、有核細(xì)胞活性及CFU-GM的數(shù)值沒有顯著性差異，表明試驗(yàn)組的消毒方式不會對臍帶血質(zhì)量造成影響。

本研究臍帶血的制備與保存均由廣東省臍血庫進(jìn)行，廣東省臍血庫擁有符合美國病理學(xué)家協(xié)會（CAP）室間質(zhì)評標(biāo)準(zhǔn)的潔凈度達(dá)標(biāo)的制備車間，并取得AABB美國血庫協(xié)會認(rèn)證和ISO9001質(zhì)量管理體系認(rèn)證。臍帶血采集采用的是三連袋，在臍帶血制備過程中，臍帶血不會與外界接觸，臍血的制備與分離能保證無菌環(huán)境。移植前對臍帶血的篩選，除了人類白細(xì)胞抗原（HLA）配型結(jié)果及血型以外，有核細(xì)胞數(shù)、CD34+細(xì)胞含量、有核細(xì)胞活性、細(xì)菌霉菌污染及CFU-GM集落計(jì)數(shù)都是評價(jià)臍帶血質(zhì)量的重要指標(biāo)[12-14]。隨著臍帶血研究的不斷深入，未來臍帶血的應(yīng)用數(shù)量及范圍將逐步上升，在保證臍帶血質(zhì)量的同時降低臍帶血污染陽性率是提高臍帶血庫存量的關(guān)鍵。

本研究就臍帶消毒方式對臍帶血污染率及臍帶血質(zhì)量的影響進(jìn)行研究，以確保臍帶血質(zhì)量的前提下，降低細(xì)菌污染陽性率。雖然試驗(yàn)組細(xì)菌/霉菌的污染率僅下降1.5%，但對于全國臍血庫年采血量上百萬份的體量，污染率下降1.5%即可有效降低因污染而導(dǎo)致的人力物力成本損耗，對現(xiàn)實(shí)操作有重要意義。本研究存在研究樣本量的局限性，后續(xù)可繼續(xù)進(jìn)行擴(kuò)大樣本量研究。

綜上所述，試驗(yàn)組的深度消毒方式不會對臍帶血的質(zhì)量產(chǎn)生影響，但是可有效降低臍帶血細(xì)菌污染率，值得臍帶血采集領(lǐng)域的關(guān)注。