付 昆，楊 艷，仲 蓬，陸一菱，趙 嵐，徐 敏

(1. 成都市第三人民醫(yī)院/西南交通大學(xué)附屬醫(yī)院，四川 成都 610031；2. 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬成都第二臨床學(xué)院，四川 成都 610031)

哮喘是最常見的慢性炎癥性疾病之一，影響著世界范圍內(nèi)約3.34億人[1]。近年來(lái)全世界自我報(bào)告和醫(yī)生診斷的哮喘成人患病率為4.3%，尤其在發(fā)達(dá)國(guó)家發(fā)病率更高[1]，這已經(jīng)成為危害人類健康的世界性公共衛(wèi)生問題之一。因此尋找效果明確、機(jī)制確切的治療策略是臨床與科研亟待解決的問題。中醫(yī)藥在防治哮喘方面積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，中藥內(nèi)服和中醫(yī)外治均有較好治療效果。伏九貼敷是成都市第三人民醫(yī)院開展的特色中醫(yī)外治療法，該療法選用帶有刺激性的藥物如白芥子、甘遂、延胡索、細(xì)辛等貼敷于相應(yīng)穴位，致使局部皮膚充血發(fā)泡，從而促進(jìn)藥物吸收以發(fā)揮藥理效應(yīng)，達(dá)到治療目的。課題組前期就伏九貼敷藥物中生、炒白芥子的不同配比對(duì)哮喘豚鼠皮膚的刺激性與抗哮喘作用相關(guān)性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)生白芥子和炒白芥子比例各半時(shí)，既可維持伏九貼敷的療效，又能減輕其對(duì)皮膚的刺激[2]。本實(shí)驗(yàn)探討了以該配比制作的伏九貼敷藥物對(duì)哮喘大鼠炎性反應(yīng)及CD4+輔助性17型T細(xì)胞(Th17)/CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)失衡的干預(yù)作用，旨在進(jìn)一步明確該外治療法的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠，體重180～220 g，由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(川)2015-30。于動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d，室溫18～25 ℃，12 h/12 h明暗交替，自由飲水、進(jìn)食。

1.2藥物與試劑 醋延胡索、醋甘遂、生芥子、炒芥子、細(xì)辛均購(gòu)自四川省中藥飲片有限公司，批號(hào)分別為200318，190524，200506，191203，200420。將芥子(生、炒各半)、延胡索、甘遂和細(xì)辛按2∶1∶1∶1比例粉碎為100目細(xì)粉，以生姜汁調(diào)成糊狀制成伏九貼敷藥物備用。卵蛋白(OVA)購(gòu)自Sigma公司，貨號(hào)：A5253；Al(OH)3：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20161130；地塞米松磷酸鈉注射液：國(guó)藥集團(tuán)容生制藥有限公司，批號(hào)：2001202；免疫球蛋白E(IgE) ELISA 試劑盒L：Elabscience，批號(hào)：6W8LLC3DE1；白細(xì)胞介素-10(IL-10)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-17(IL-17) ELISA 試劑盒均來(lái)自聯(lián)科生物，批號(hào)：A31001113，A38200623，A301B01033，A31701113；二甲苯、無(wú)水乙醇、中性樹膠：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，貨號(hào)：10023418，100092683，10004160；蘇木素-伊紅試劑盒：武漢谷歌生物，貨號(hào)：G1005。

1.3主要儀器 PL-203型電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；NE-C801壓縮式霧化器[歐姆龍(大連)有限公司]；JJ-12J脫水機(jī)、JB-P5包埋機(jī)(武漢俊杰電子有限公司)；RM2016型切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司)；Neofuge 15R高速冷凍離心機(jī)(Heal Force)；Eclipse E100正置光學(xué)顯微鏡(日本尼康)；DS-U3成像系統(tǒng)(日本尼康)；Epoch酶標(biāo)儀(BioTeK)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法 按照隨機(jī)數(shù)字表將30只大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、假貼敷組、伏九貼敷組和地塞米松組。于實(shí)驗(yàn)第1天和第7天，正常組大鼠腹腔注射生理鹽水1 mL，其余各組大鼠腹腔注射1 mL含有OVA 100 mg、Al(OH)3100 mg的混合液致敏。從第15天開始，正常組大鼠給予生理鹽水霧化吸入，其余組大鼠給予1% OVA霧化吸入，均每天1次，每次20 min，連續(xù)7 d。末次霧化結(jié)束后，假貼敷組和伏九貼敷組用脫毛膏對(duì)取穴部位進(jìn)行脫毛，第2天取調(diào)制好的伏九貼敷藥物適量，按照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[3]取穴方法敷于伏九貼敷組大鼠大椎、肺俞(雙側(cè))、腎俞(雙側(cè))穴并用膠布固定，假貼敷組同樣方法貼無(wú)藥空白膠布，均每次貼敷4 h，隔日貼敷1次，共7次；地塞米松組腹腔注射地塞米松0.5 mg/kg，隔日1次，共7次；正常組和模型組不做任何處理。

1.5觀察指標(biāo)及方法

1.5.1肺組織病理學(xué)觀察 末次貼敷后24 h處死大鼠，取右肺組織固定24 h以上，依次梯度乙醇脫水，石蠟包埋，制備3 μm切片，脫蠟至水，蘇木素-伊紅染色，脫水封片，顯微鏡下觀察病理形態(tài)，并采集圖像，參考文獻(xiàn)[4-6]評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)4項(xiàng)主要病理改變進(jìn)行評(píng)分。①支氣管周圍炎性浸潤(rùn)：幾乎沒有為0分；少量、分散為1分；1層浸潤(rùn)為2分；2～4層(圈)浸潤(rùn)為3分；4 層(圈)以上浸潤(rùn)為4分。②上皮細(xì)胞脫落：無(wú)或偶見脫落為0分；輕度脫落(稀疏、散在)為1分；中度脫落為2分；重度脫落為3分。③組織水腫：無(wú)水腫為0分；輕度彌漫性水腫為1分；中度肺泡和細(xì)支氣管水腫為2分；區(qū)域性水腫為3分；肺炎樣水腫為4分。④肺泡間隔增厚：間隔正常為0分；增至正常厚度的1～2倍為1分；增至正常厚度的3～5倍為2分；增至正常厚度的5倍以上為3分。

1.5.2炎性因子及細(xì)胞因子檢測(cè) 末次貼敷后24 h麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，4 ℃下2 000 r/min 離心(離心半徑6 cm)10 min，取上清，嚴(yán)格遵照ELISA試劑盒操作步驟檢測(cè)血清IgE、TNF-α、IL-1β、IL-17、IL-10水平。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠肺組織HE染色表現(xiàn) 正常組大鼠支氣管黏膜上皮完整，肺泡清晰完整，間隔形態(tài)正常，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)或散在少量炎性細(xì)胞，輕微肺間質(zhì)增生；模型組和假貼敷組大鼠支氣管黏膜上皮細(xì)胞受損和脫落明顯，氣道壁不完整，黏膜下層炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及水腫，支氣管腔狹窄，肺泡內(nèi)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡間隔明顯增厚；伏九貼敷組和地塞米松組大鼠支氣管上皮較完整，支氣管黏膜偶見炎性細(xì)胞浸潤(rùn), 上皮細(xì)胞散在脫落，肺間質(zhì)輕微增生。見圖1。

圖1 正常組和哮喘各組大鼠肺組織HE染色病理形態(tài)學(xué)表現(xiàn)

2.2各組大鼠肺組織病變半定量評(píng)分比較 模型組和假貼敷組大鼠肺組織炎性浸潤(rùn)評(píng)分、上皮細(xì)胞脫落評(píng)分、組織水腫評(píng)分及肺泡間隔增厚評(píng)分均明顯高于正常組(P均<0.05)；伏九貼敷組和地塞米松組上述各項(xiàng)評(píng)分均明顯低于模型組(P均<0.05)。見表1。

表1 正常組和哮喘各組大鼠肺組織病理評(píng)分比較[Q2(Q1,Q3)，分]

2.3各組大鼠血清IgE、TNF-α、IL-1β及Th17、Treg相關(guān)細(xì)胞因子水平比較 模型組和假貼敷組大鼠血清IgE、TNF-α、IL-1β、IL-17水平均明顯高于正常組(P均<0.05)，血清IL-10水平均明顯低于正常組(P均<0.05)。伏九貼敷組和地塞米松組血清IgE、TNF-α、IL-1β、IL-17水平均明顯低于模型組(P均<0.05)，血清IL-10水平明顯高于模型組(P均<0.05)，且血清IL-1β和IL-17水平與正常組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表2。

表2 正常組和哮喘各組大鼠血清炎癥因子及Th17、Treg相關(guān)細(xì)胞因子水平比較

2.4血清炎性因子及肺組織病理評(píng)分與血清IL-17、IL-10水平的相關(guān)性 肺組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)評(píng)分、上皮細(xì)胞脫落評(píng)分、組織水腫評(píng)分、肺泡間隔增厚評(píng)分及血清IgE、TNF-α、IL-1β水平與血清IL-17水平均呈顯著正相關(guān)性(P均<0.05)，與血清IL-10水平則呈顯著負(fù)相關(guān)性(P均<0.05)。見表3。

表3 血清炎性因子及肺組織病理評(píng)分與血清IL-17、IL-10水平間相關(guān)性分析

3 討 論

穴位貼敷療法是中醫(yī)學(xué)特有的外治法之一。清代醫(yī)家張璐發(fā)明的中藥白芥子外涂治療咳喘病的方法被后世醫(yī)家視為穴位貼敷治療支氣管哮喘和支氣管炎的經(jīng)典方法而一直沿用至今，本院開展的冬病夏治伏九貼敷療法也是在此基礎(chǔ)上加減而來(lái)。本實(shí)驗(yàn)采用OVA聯(lián)合Al(OH)3誘導(dǎo)大鼠哮喘模型，探討了伏九貼敷藥物對(duì)肺組織病理改變的影響。結(jié)果顯示，造模后大鼠出現(xiàn)了支氣管、細(xì)支氣管上皮細(xì)胞壞死脫落，支氣管周圍炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及水腫，支氣管腔狹窄，肺間質(zhì)增生，肺泡壁增厚等肺組織損傷改變，這與人類哮喘的肺部炎癥病理特征相符；伏九貼敷藥物干預(yù)后，無(wú)論是HE染色還是炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、上皮細(xì)胞脫落、組織水腫、肺泡間隔增厚評(píng)分，都顯示伏九貼敷藥物可明顯改善哮喘大鼠上述肺部炎癥病理改變。

IgE是機(jī)體血漿中的一種免疫球蛋白，通常用于過敏性疾病患者的診斷。研究發(fā)現(xiàn)，哮喘患者具有血清IgE、C反應(yīng)蛋白和嗜酸性粒細(xì)胞升高等特征[7]。當(dāng)過敏原進(jìn)入體內(nèi)時(shí)，T細(xì)胞和B細(xì)胞分化為漿細(xì)胞，產(chǎn)生IgE抗體，特異性IgE抗體與其高親和力受體FcεRI結(jié)合，激活肥大細(xì)胞。在FcεRI交聯(lián)的幾分鐘內(nèi)，肥大細(xì)胞脫顆粒，釋放前列腺素、白三烯和組胺。數(shù)小時(shí)后，肥大細(xì)胞分泌IL-1β、TNF-α、MIP-1α、IL-13等細(xì)胞因子和各種趨化因子，這些細(xì)胞因子共同引起白細(xì)胞浸潤(rùn)和持續(xù)炎癥[8-9]。本實(shí)驗(yàn)中OVA和Al(OH)3作為過敏原致敏激發(fā)大鼠哮喘，誘導(dǎo)其體內(nèi)產(chǎn)生IgE抗體，引發(fā)免疫變態(tài)反應(yīng)，血清IgE水平顯著增加，大量促炎因子IL-1β、TNF-α釋放，引起大鼠出現(xiàn)哮喘免疫炎癥反應(yīng)；穴位貼敷伏九貼后，IgE和IL-1β、TNF-α水平均顯著降低，結(jié)合肺組織HE染色病理結(jié)果，提示伏九貼敷藥物能有效改善哮喘大鼠炎性損傷，對(duì)哮喘炎性反應(yīng)有明顯的拮抗作用。

盡管人們對(duì)哮喘的認(rèn)識(shí)不斷提高，但其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。目前研究認(rèn)為許多免疫細(xì)胞，特別是活化的T細(xì)胞可釋放細(xì)胞因子，共同作用引起哮喘的發(fā)生[10]。其中Th2優(yōu)勢(shì)分化的Th1/Th2失衡是哮喘發(fā)病的一個(gè)重要免疫學(xué)機(jī)制的觀點(diǎn)占據(jù)了主流，但由于哮喘發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性，Th2占優(yōu)勢(shì)的Th1/Th2失衡只是哮喘免疫機(jī)制的一部分，并不能完全解釋哮喘的發(fā)病機(jī)制[11]。近年研究表明Th細(xì)胞是可塑的，新的Th細(xì)胞也能觸發(fā)和擴(kuò)大哮喘的炎癥反應(yīng)。Th17細(xì)胞屬于截然不同的CD4+T細(xì)胞效應(yīng)器家族，可分泌IL-17，IL-17能募集中性粒細(xì)胞，促進(jìn)局部組織產(chǎn)生中性粒細(xì)胞相關(guān)趨化因子，從而加重局部炎癥反應(yīng)[12]。Treg細(xì)胞是一類控制免疫應(yīng)答的T細(xì)胞亞群，其可通過分泌IL-10、TGF-β等細(xì)胞因子發(fā)揮免疫抑制作用，已經(jīng)作為免疫抑制驅(qū)動(dòng)器被廣泛報(bào)道，在哮喘中也起著重要作用[13-16]。體內(nèi)免疫穩(wěn)態(tài)時(shí)，Th17和Treg相互制約，處于平衡狀態(tài)，Th17/Treg細(xì)胞失衡會(huì)導(dǎo)致哮喘發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增高，因此研究Th17/Treg細(xì)胞失衡的分子機(jī)制成為當(dāng)前熱點(diǎn)[16-17]。相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，小鼠反復(fù)暴露于低劑量過敏原可促進(jìn)調(diào)節(jié)性CD4+T細(xì)胞群的發(fā)育[18]，Treg細(xì)胞能抑制Th2和Th17細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，防止哮喘動(dòng)物模型氣道炎癥和支氣管高反應(yīng)的發(fā)生[19]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，哮喘大鼠血清中Th17相關(guān)細(xì)胞因子IL-17水平明顯升高，Treg相關(guān)細(xì)胞因子IL-10水平明顯降低，出現(xiàn)Th17/Treg平衡向Th17漂移的現(xiàn)象；相關(guān)性分析顯示，哮喘大鼠肺組織病理?yè)p傷各項(xiàng)指標(biāo)及IgE、TNF-α、IL-1β水平與血清IL-17水平呈正相關(guān)，與血清IL-10水平呈負(fù)相關(guān)。提示Th17細(xì)胞增殖分化過多，作為促炎因子，過多的Th17細(xì)胞會(huì)正向誘導(dǎo)IgE、TNF-α、IL-1β水平升高，加重肺組織炎性損傷；Treg細(xì)胞免疫抑制功能減弱，不能有效抑制免疫應(yīng)答，也導(dǎo)致IgE、TNF-α、IL-1β大量表達(dá)，造成哮喘大鼠肺部炎性損傷，提示Th17/Treg失衡介導(dǎo)哮喘炎癥免疫應(yīng)答。經(jīng)伏九貼敷藥物干預(yù)后，血清IL-10水平升高，血清IL-17水平降低，糾正了Th17/Treg漂移，減輕了Th17/Treg失衡介導(dǎo)的炎性反應(yīng)，故IgE、TNF-α、IL-1β水平也隨之降低，哮喘大鼠肺組織病理?yè)p傷亦隨之減輕。

綜上所述，伏九貼敷藥物能有效減輕哮喘大鼠肺組織炎性損傷，減少IgE產(chǎn)生，降低外周血中炎性因子水平，對(duì)哮喘炎性變態(tài)反應(yīng)有良好的拮抗作用，機(jī)制可能與其調(diào)節(jié)Th17/Treg失衡有關(guān)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。