陳芳芳，周 洋，王桂蘭，吳小波，康厚鑫

傳染性單核細(xì)胞增多癥（infectious mononucleosis, IM）是感染性疾病，主要由EBV感染引起[1-2]。IM患兒體內(nèi)有大量單核細(xì)胞急性增生，可造成多器官損傷，少數(shù)IM會誘發(fā)惡性腫瘤，且有較高的發(fā)病率[3-5]。近年來，IM易被臨床醫(yī)生誤診為急性化膿性扁桃體炎等疾病，導(dǎo)致患兒錯失最佳治療時機[6]。有文獻(xiàn)報道EBV是IM發(fā)病的基礎(chǔ)[7-8]。近年來發(fā)現(xiàn)微小RNA（microRNA,miRNA）對細(xì)胞的基因表達(dá)具有廣泛調(diào)控作用，隨著深入研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在病毒感染中也可發(fā)揮重要作用[9]。 miR-155是免疫反應(yīng)的主要調(diào)控因子，可維持免疫平衡，尤其對調(diào)控T細(xì)胞起著關(guān)鍵作用[10]。有文獻(xiàn)報道m(xù)iR-155在無癥狀期HIV感染者血漿中呈高表達(dá)，且miR-155與CD3+T細(xì)胞數(shù)量、CD4+T細(xì)胞數(shù)量具有密切關(guān)系[11]。目前，miR-155與IM患兒病情的關(guān)系鮮有文獻(xiàn)報道，基于此，本研究擬探索IM患兒血漿中miR-155表達(dá)水平并分析其與EBV DNA載量的關(guān)系，以期為早期預(yù)估IM患兒病情提供依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 對象 選取2017年3月—2021年3月秦皇島市第一醫(yī)院收治的96例活動期IM患兒（活動期IM組）和81例緩解期IM患兒（緩解期IM組）作為研究對象，其中，活動期IM組男53例，女43例，年齡4～11歲，平均年齡（6.74±1.97）歲；緩解期IM組男46例，女35例，年齡4～11歲，平均年齡（6.62±2.03）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《兒童主要非腫瘤性EB病毒感染相關(guān)疾病的診斷和治療原則建議》[12]中IM的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)；②初次感染EBV致IM，活動期發(fā)病時間在一周內(nèi)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①入組前3個月服用細(xì)胞毒性藥物或糖皮質(zhì)激素；②合并先天性免疫缺陷疾??；③合并細(xì)菌感染；④使用過丙種球蛋白治療。選擇同期在我院體檢的健康兒童90例作為對照組，男48例，女42例，年齡4～12歲，平均年齡（6.88±2.17）歲?；顒悠贗M組、緩解期IM組、對照組在性別、年齡上差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05），見表1。本研究中患兒家屬均知情同意，且通過我院倫理委員會批準(zhǔn)（批件號LW2017-0103）。

表1 3組年齡、性別資料比較Table 1 Comparison of age and gender data among the 3 groups

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 用EDTA-K2抗凝管采集患兒及健康兒童清晨空腹靜脈血1～2 ml，置于-80 ℃冰箱保存。

1.2.2 miR-155表達(dá)水平檢測 取出凍存樣本，解凍。離心，分離出上層血漿成分。遵照RNA提取試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）操作步驟提取血漿總RNA，用UV-1100紫外分光光度儀（濟南歐萊博科學(xué)儀器有限公司）檢測RNA濃度，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（上?？道噬锟萍加邢薰荆┓崔D(zhuǎn)錄得到cDNA。采用CFX96實時熒光定量PCR儀對miR-155及內(nèi)參U6進(jìn)行擴增反應(yīng)。引物由上海生工合成。miR-155正向引物5’-CTCGTGGTTAATGCTAATTGTGA-3’，反向引物 5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；內(nèi)參 U6 正向引 物 5’-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3’，反向引物 5’-GGAACGCTTCACGAATTTG-3’。反應(yīng)條件：95 ℃，3 min；95 ℃，30 s，59 ℃，30 s，72 ℃，40 s；40個循環(huán)。采用2--??CT法計算miR-155表達(dá)水平 。

1.2.3 EBV DNA載量檢測 采用實時熒光定量PCR法檢測血漿中EBV DNA載量，用EBV核酸擴增熒光定量試劑盒（中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司），按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計算EBV DNA載量。按照EBV DNA峰值載量將活動期IM患兒分為[13]：EBV DNA≥3.38 lg拷貝/ml組（56例）和EBV DNA＜3.38 lg拷貝/ml組（40例）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 25.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計數(shù)資料用例（%）表示，組間比較采用R×C χ2檢驗。計量資料符合正態(tài)分布，以±s表示，2組間比較行t檢驗；多組比較行單因素方差分析，組內(nèi)2組間均數(shù)相比行q檢驗。采用Pearson相關(guān)性分析對miR-155水平與EBV DNA載量的相關(guān)性進(jìn)行分析，采用ROC曲線評估血漿miR-155水平對活動期IM患兒的預(yù)測價值。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 健康兒童與IM患兒血漿miR-155水平比較 與對照組相比，緩解期IM組、活動期IM組血漿miR-155水平均較高（P均＜0.05），與緩解期IM組相比，活動期IM組血漿miR-155水平較高（P＜0.05），見表2。

表2 對照組與IM患兒血漿miR-155水平比較（±s）Table 2 Comparison of plasma miR-155 levels between healthy children and IM children (±s )

表2 對照組與IM患兒血漿miR-155水平比較（±s）Table 2 Comparison of plasma miR-155 levels between healthy children and IM children (±s )

注：*. 與對照組相比， P＜0.05；#. 與緩解期IM組相比， P＜0.05

組別 n miR-155活動期IM組 96 2.97±0.73*#緩解期IM組 81 1.94±0.42*對照組 90 1.05±0.24 F值 265.725 P值 0.000

2.2 不同EBV DNA載量活動期IM患兒血漿miR-155水平比較 與EBV DNA＜3.38 lg拷貝/ml組相比，EBV DNA≥3.38 lg拷貝/ml組血漿miR-155水平較高（P＜0.05），見表3。

表3 不同EBV DNA載量活動期IM患兒血漿miR-155水平比較（ ±s ）Table 3 Comparison of plasma miR-155 levels in IM children with different EBV DNA loads during active periods ( ±s )

表3 不同EBV DNA載量活動期IM患兒血漿miR-155水平比較（ ±s ）Table 3 Comparison of plasma miR-155 levels in IM children with different EBV DNA loads during active periods ( ±s )

組別 n miR-155 EBV DNA≥3.38 lg拷貝/ml組 56 3.08±0.81 EBV DNA＜3.38lg拷貝/ml組 40 2.38±0.62 t值 4.587 P值 0.000

2.3 活動期IM患兒血漿miR-155水平與EBV DNA載量的關(guān)系 經(jīng)Pearson相關(guān)性分析，活動期IM患兒血漿miR-155水平與EBV DNA載量呈正相關(guān)（r=0.547，P=0.000），見圖1。

圖1 血漿miR-155水平與EBV DNA載量的相關(guān)性Figure 1 Correlation between plasma miR-155 level and EBV DNA load

2.4 血漿miR-155水平對活動期IM患兒的預(yù)測價值 以緩解期IM患兒血漿miR-155水平為對照，ROC曲線顯示，血漿中miR-155水平預(yù)測活動期IM患兒的AUC為0.869（95%CI：0.817～0.920），截斷值為2.49，約登指數(shù)0.597，其敏感度、特異度分別為65.90%、93.80%，見圖2。

圖2 血漿miR-155水平預(yù)測活動期IM患兒的ROC曲線Figure 2 plasma miR-155 level predicts ROC curve of children with IM during active phase

3 討 論

IM是由EBV感染引起的感染性疾病，臨床發(fā)現(xiàn)IM患兒可死于脾破裂、氣道阻塞等，少數(shù)IM患兒會伴發(fā)神經(jīng)炎、肝損傷等并發(fā)癥[14]。兒童期EBV感染可能導(dǎo)致患兒成年后仍伴有不良并發(fā)癥，因此，早期診斷IM有重要意義。

目前，臨床上多用EBV抗體特異性檢測和EBV DNA載量檢測判斷EBV感染情況。近年來有文獻(xiàn)報道EBV DNA載量對IM具有診斷價值[15]。miRNA是長約18～25 nt的核苷酸，具有免疫調(diào)控功能。有研究報道m(xù)iRNA參與免疫調(diào)節(jié)過程[16]。miR-155位于21號染色體上，是miRNA家族重要成員，在T細(xì)胞分化中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。T細(xì)胞是淋巴細(xì)胞的重要成員，按CD4、CD8表型分類，T細(xì)胞可分為CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞。嚴(yán)格控制T細(xì)胞活化，可實現(xiàn)對傳染病的有效免疫調(diào)控。國外文獻(xiàn)報道，miR-155是抗病毒防御過程中激活CD4+T細(xì)胞所必需的[17]。國內(nèi)文獻(xiàn)報道肺結(jié)核患者外周血單個核細(xì)胞中miR-155高表達(dá)誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞向細(xì)胞毒性T細(xì)胞分化[18]。miR-155在炎癥反應(yīng)中也發(fā)揮重要作用。Zhang等[19]研究顯示miR-155高表達(dá)可通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)從而促進(jìn)小鼠腹主動脈瘤病情進(jìn)展。Alivernini等[20]研究顯示miR-155可參與巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞的生物學(xué)調(diào)控，且miR-155是通過靶向調(diào)控含有SH2結(jié)構(gòu)的5肌醇磷酸酶-1表達(dá)來調(diào)控炎性細(xì)胞產(chǎn)生炎性因子。但Natekar等[21]研究顯示與野生型小鼠相比，miR-155基因敲除小鼠感染西尼羅河病毒后病毒載量更高，miR-155在神經(jīng)元細(xì)胞中的過表達(dá)可通過調(diào)節(jié)抗病毒細(xì)胞因子，導(dǎo)致西尼羅河病毒載量明顯降低?？赡躮iR-155對不同的病毒可發(fā)揮不同的調(diào)控作用，當(dāng)感染西尼羅河病毒，miR-155在體內(nèi)可能發(fā)揮保護(hù)因素。本研究發(fā)現(xiàn)對照組、緩解期IM組、活動期IM組血漿miR-155水平依次顯著升高，提示miR-155水平變化可能與IM患兒病情進(jìn)程有關(guān)。Chen等[22]研究顯示miR-155高水平可通過增強細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)抑制蛋白1（suppressors of cytokine sigmaling 1, SOCS1）途徑增強HBV復(fù)制。本研究發(fā)現(xiàn)，EBV DNA＜3.38 lg拷貝/ml組相比，EBV DNA≥3.38 lg拷貝/ml組血漿miR-155水平較高，提示IM患兒EBV復(fù)制可能與miR-155水平有關(guān)。推測miR-155可能通過調(diào)控SOCS1途徑，進(jìn)而調(diào)控EBV 復(fù)制。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)血漿中miR-155水平預(yù)測活動期IM患兒的AUC為0.869，其敏感度、特異度分別為65.90%、93.80%，提示血漿miR-155對預(yù)估活動期IM患兒具有一定的價值，但miR-155水平預(yù)測活動期IM患兒敏感度較低，可能原因與EBV感染機體后的潛伏期有關(guān)。但miR-155影響IM患兒EBV DNA載量的具體調(diào)節(jié)機制尚未完全闡明，后續(xù)還須深入探究。

綜上所述，活動期IM患兒血漿中miR-155水平呈高表達(dá)，與EBV DNA載量呈正相關(guān)。血漿miR-155水平對活動期IM患兒具有較好的預(yù)測價值，為臨床上闡明活動期IM患兒EBV DNA載量升高機制奠定基礎(chǔ)。