吳剛正，常國立，單 碩，王慧俐，朱瑞瑜，蔡成崗

（1.浙江科技學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江 杭州 310023；2.浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310023；3.杭州萬向職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江 杭州 310023）

枇杷（Eriobotrya japonica） 為薔薇科植物，品種資源豐富，原產(chǎn)于我國東南部，是我國特產(chǎn)水果，目前年產(chǎn)量為40～60 萬t[1]，占世界枇杷總產(chǎn)量的50%以上。枇杷具有豐富的營養(yǎng)價(jià)值，含有人體所需的碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂肪、氨基酸等多種營養(yǎng)成分[2-3]，深得消費(fèi)者的喜愛。枇杷花、葉及核主要用于生產(chǎn)枇杷露、枇杷膏等止咳藥物，枇杷的功效成分研究主要集中在枇杷葉中的熊果酸、齊墩果酸、黃酮等物質(zhì)和枇杷核的苦杏仁苷上[4]?？嘈尤受盏乃幱霉πе饕w現(xiàn)在鎮(zhèn)咳平喘[5]、抗腫瘤[6]、抗炎[7-8]、抗氧化[9-10]等方面，同時(shí)會(huì)影響消化系統(tǒng)[11]，具有消炎、鎮(zhèn)痛[12]等作用[13]。

枇杷的采收期較短，主要用于鮮食，少量用于加工成果汁、果脯及罐頭產(chǎn)品等，其深加工及綜合利用技術(shù)還有待于加強(qiáng)[14]，目前加工的產(chǎn)品中，枇杷核均未得到有效利用，作為副產(chǎn)物，一般被當(dāng)作廢棄物丟棄[15]。枇杷核含有豐富的營養(yǎng)成分，除具有鎮(zhèn)咳平喘和抗腫瘤等多種生物活性的苦杏仁苷[16]以外，還含有淀粉、蛋白質(zhì)和脂肪酸等成分，其中蛋白質(zhì)含有15 種氨基酸，賴氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、蘇氨酸和色氨酸為必需氨基酸[17]，脂肪酸包含亞油酸、棕櫚酸、油酸、α-亞麻酸、硬脂酸等脂肪酸；按果核占果質(zhì)量的20%計(jì)算，每年會(huì)產(chǎn)生3～4 萬t 的枇杷核廢棄物，不僅造成資源浪費(fèi)，而且污染環(huán)境。

苦杏仁苷（Amygdalin，C20H27O11） 廣泛存在于杏、桃、李子、蘋果、山楂等多種薔薇科植物果實(shí)的種子中，尤其在苦杏仁中含量較多，為2%～ 3%，是枇杷果核中主要的藥用成分之一[18]，早在1803 年Schrader 研究苦杏仁成分時(shí)就發(fā)現(xiàn)了該類物質(zhì)，至1830 年Robiquet 等人從中分離出苦杏仁苷，迄今已成為醫(yī)藥上常用的祛痰止咳劑、輔助性抗癌藥物[19]。目前，對苦杏仁苷的貯藏和穩(wěn)定性進(jìn)行分析的研究較少，試驗(yàn)采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)得到提取枇杷籽中苦杏仁苷的最佳條件，而后又對比了貯藏、干燥處理對苦杏仁苷含量的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枇杷籽粉，購自中藥房，規(guī)格0.5kg/ 包；苦杏仁苷，純度97%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供；乙醇（分析醇），美國“天地”公司提供；甲醇，色譜純，杭州匯普試劑有限公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

PTX-FA210 型電子天平，福州華志科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；KQ3200 型超聲波清洗器（工作頻率kHz，超聲功率150 W），昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；H1650R 型醫(yī)用離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司產(chǎn)品；LC-20AD 型高效液相色譜儀、紫外檢測器，日本島津公司產(chǎn)品。

1.3 色譜分析與定量

1.3.1 色譜檢測條件

色譜柱：CLS-ODS 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水溶液（20∶80）；檢測波長210 nm，柱溫30 ℃，流速0.8 mL/min，進(jìn)樣量10 μL。

1.3.2 苦杏仁苷標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

精密稱取苦杏仁苷標(biāo)準(zhǔn)品17.02 mg，加入甲醇溶解，定容至10 mL，即得到質(zhì)量濃度1.7 mg/mL 的苦杏仁苷標(biāo)準(zhǔn)溶液。經(jīng)梯度稀釋獲得質(zhì)量濃度為340，170，34，17，3.4 μg/mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液，過0.22 μm膜后采用HPLC 測試。以峰面積為縱坐標(biāo)，苦杏仁苷的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)作圖，得到線性回歸方程：Y=173 146X-46 355，R2=0.999 8，苦杏仁苷在3.4～340 μg/mL 的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

1.3.3 苦杏仁苷提取量的測定

稱取0.2 g 枇杷核粉末，加入乙醇溶液后，進(jìn)行超聲波提取，再將得到的提取液以轉(zhuǎn)速7 000 r/min離心10 min，上清液過0.5 μm 濾膜后以HPLC 測試。

1.4 苦杏仁苷提取試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法。分別以不同的提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、料液比做單因素試驗(yàn)，考查各單因素對苦杏仁苷提取量的影響。結(jié)果表明，最佳的單因素條件分別為提取溫度60 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，料液比1∶20，提取時(shí)間40 min。在單因素試驗(yàn)的研究基礎(chǔ)上，選擇3 個(gè)因素進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，以苦杏仁苷的提取量為依據(jù)，篩選主要因素，得出從枇杷核中醇提苦杏仁苷的最優(yōu)化工藝提取條件。

正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1 苦杏仁苷含量測定

苦杏仁苷標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見圖1。?

建立HPLC 測定苦杏仁苷標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的檢測方法，并分析枇杷樣品中苦杏仁苷的含量。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，利用公式算出枇杷核中苦杏仁苷的提取濃度及提取率。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案開展正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

正交試驗(yàn)結(jié)果分析見表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

由極差R 值可知，影響枇杷核中苦杏仁苷提取的因素大小順序?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)>提取溫度>提取時(shí)間。所以選擇A2B3C1為最佳醇提工藝條件。即超聲波醇提1 次工藝的最佳條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，提取時(shí)間60 min，提取溫度40 ℃，也即是試驗(yàn)的第6 組試驗(yàn)，苦杏仁苷達(dá)到250.60 μg/mL，提取率為2.51%。

2.3 貯藏與干燥對苦杏仁苷含量的影響

對比了室溫貯藏2 年的枇杷籽提取物樣品，發(fā)現(xiàn)苦杏仁苷的提取率有明顯下降，僅為0.12%，下降比例超過95%，因而認(rèn)為苦杏仁苷的貯藏過程中會(huì)損失。為進(jìn)一步考查枇杷籽中苦杏仁苷的穩(wěn)定性，以新鮮制備的枇杷籽為原料，測定了不同干燥條件對苦杏仁苷提取率的影響，105 ℃干燥30 min 后的枇杷籽中苦杏仁苷的提取率為0.15%，60 ℃干燥90 min 后的枇杷籽中苦杏仁苷的提取率為0.17%，苦杏仁苷在干燥過程中損失較大。

新鮮枇杷的樣品色譜圖見圖2，新鮮與干燥處理對苦杏仁苷提取率的影響見表3。

圖2 新鮮枇杷的樣品色譜圖

表3 新鮮與干燥處理對苦杏仁苷提取的影響

由結(jié)果可知，放置2 年的枇杷籽樣品與60 ℃干燥后的枇杷籽樣品其苦杏仁苷含量減少量都在95%以上。

3 結(jié)論

通過了正交試驗(yàn)得到了最佳提取條件，其中正交試驗(yàn)最佳參數(shù)為乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，40 ℃時(shí)提取60 min，提取率2.5%；常溫貯藏2 年的樣品苦杏仁苷損失達(dá)到95%以上，枇杷籽粉在60 ℃干燥90 min和105 ℃干燥30 min 后苦杏仁苷的提取率僅為干燥前的4.4%和5.0%，損失較大，其變化過程（如形成新的化合物或者揮發(fā)損失） 需要進(jìn)一步進(jìn)行確證。研究結(jié)果也表明，枇杷籽粉中的苦杏仁苷在干燥過程損失較大，需要低溫密封貯藏，以減少苦杏仁苷的損失，促進(jìn)枇杷籽的加工和利用。