馮成龍，劉暢，李波，沈童飛，金姍姍，趙金諾，劉家佑，張君輝，姜思琦，石婉瑩

（齊齊哈爾大學(xué) 1.生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，2.抗性基因工程與寒地生物多樣性保護(hù)黑龍江重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

在各種不利條件下，植物可以通過多種基因調(diào)控機(jī)制恢復(fù)和重建細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài).科學(xué)家對(duì)與環(huán)境脅迫相關(guān)的基因進(jìn)行了大量研究，包括基因表達(dá)模式、轉(zhuǎn)錄后修飾模式以及由基因編碼的蛋白質(zhì)的功能和作用模式[1].相關(guān)研究豐富了植物適應(yīng)干旱、鹽堿、低溫和高溫等非生物脅迫的抗性理解，從而擴(kuò)大耕地面積，提高作物產(chǎn)量.近年來，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)表觀遺傳修飾廣泛參與植物的脅迫反應(yīng).

表觀遺傳修飾主要包括DNA 甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑和非編碼RNA[1]，將影響染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)和可塑性，并動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)基因表達(dá).DNA 甲基化是研究最廣泛的表觀遺傳修飾類型，它是通過改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA 構(gòu)象、DNA 穩(wěn)定性以及DNA 與蛋白質(zhì)之間的相互作用調(diào)控基因表達(dá)[2].對(duì)于植物體而言，環(huán)境發(fā)生變化會(huì)導(dǎo)致與之相對(duì)應(yīng)的表觀遺傳變異，在植物非生物脅迫反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用，使植物能夠在惡劣的環(huán)境中生存.本文主要綜述了近年來DNA 甲基化的基本概況，以及牧草應(yīng)對(duì)非生物脅迫下的DNA甲基化調(diào)控，旨在為利用表觀遺傳機(jī)制提高牧草的抗脅迫能力研究提供指導(dǎo).

1 DNA 甲基化概述

1.1 DNA 甲基化概念和修飾方式

DNA 甲基化是指DNA 復(fù)制后，在DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase，DNMT）催化下，將S-腺苷酰甲硫氨酸（S-adenosyl-methionine，SAM）分子上的甲基（-CH）轉(zhuǎn)移到DNA 分子中胞嘧啶殘基的5位碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶（m5C）的過程[3].DNA 甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾形式，在植物、細(xì)菌和哺乳動(dòng)物中廣泛存在，修飾方式多種多樣，被修飾的位點(diǎn)堿基有腺嘌呤N-6 位、胞嘧啶N-4 位、鳥嘌呤N-7 位或胞嘧啶C-5 位等，其甲基供體由SAM 提供，在DNMT 的催化作用下，以共價(jià)鍵結(jié)合的方式獲得一個(gè)甲基基團(tuán)的化學(xué)修飾過程[4].其產(chǎn)物5-甲基胞嘧啶（m5C）是植物DNA 甲基化的主要形式，在維持基因組穩(wěn)定、抑制內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒、X 染色體失活、基因組印記和發(fā)育基因調(diào)控等多種生物學(xué)過程中，DNA 甲基化起著至關(guān)重要的作用，現(xiàn)已成為分子生物學(xué)的主要研究方向之一.

1.2 植物DNA 甲基化的主要特點(diǎn)

（1）修飾方式.植物DNA 甲基化修飾方式主要為5-甲基胞嘧啶（m5C），少量為N6-甲基腺嘌呤（N6-mA）和7-甲基鳥嘌呤（N7-mG），其中m5C 修飾方式占DNA 中胞嘧啶堿基的1/3；（2）發(fā)生區(qū)域.植物DNA 甲基化主要發(fā)生在CpG 區(qū)序列中，還可在CHG 和CHH（H=A，C 或T）序列中發(fā)生，但發(fā)生頻率較低；（3）甲基化程度.著絲粒和中心體周圍區(qū)域、核糖體RNA 編碼序列、轉(zhuǎn)座子序列等異染色質(zhì)區(qū)域的DNA 甲基化程度較高，多數(shù)啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化程度較低，通常甲基化不會(huì)發(fā)生在非重復(fù)基因位點(diǎn)[4]；（4）甲基化水平.植物基因組DNA 甲基化比例較動(dòng)物高[5].

2 牧草DNA 甲基化檢測(cè)方法和建立

2.1 牧草DNA 甲基化的檢測(cè)方法

近年來，甲基化分析方法發(fā)展迅速，可以分為基因組DNA 的甲基化檢測(cè)法和特定DNA 片段的甲基化檢測(cè)法兩大類.在牧草DNA 甲基化檢測(cè)技術(shù)中，主要分為高效液相色譜技術(shù)（high performance liquid chromatography，HPLC）、甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性技術(shù)（methylation sensitive amplification polymorphism，MSAP）、亞硫酸氫鹽測(cè)序法（bisulfite sequencing，BS）等技術(shù)手段.需要根據(jù)具體研究目標(biāo)、參考基因組序列的可用性和樣本數(shù)量等選擇相應(yīng)的檢測(cè)技術(shù)，目前對(duì)牧草基因組DNA 的甲基化檢測(cè)法多采用MSAP技術(shù)（見表1）.

表1 牧草DNA 甲基化檢測(cè)方法與基因表達(dá)功能分析

2.2 牧草DNA 甲基化的建立

牧草DNA 甲基化主要是發(fā)生在胞嘧啶5′C 位置的甲基化，在基因組序列的CG，CHG 和CHH 序列中的胞嘧啶上均可發(fā)生，3 種DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（見表2）的綜合作用影響DNA 甲基化的水平和DNA 甲基化是否發(fā)生，分別為維持型甲基轉(zhuǎn)移酶Ⅰ（maintenance methyltranferaseⅠ，METⅠ）、結(jié)構(gòu)域重排甲基轉(zhuǎn)移酶（Domains rearranged methyltransferase，DRM）、染色質(zhì)甲基化酶（Chromomethylase，CMT）[20].

表2 DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶的作用

植物中有2 種甲基化模式：一為從頭甲基化，指以前未甲基化的DNA 雙鏈的胞嘧啶的甲基化過程，靠維持型甲基化酶來保持其穩(wěn)定狀態(tài)；二為DNA 甲基化的維持，指細(xì)胞分裂的復(fù)制過程中，通過維持甲基化酶的作用，在DNA 半保留復(fù)制出的新生鏈相應(yīng)位置上進(jìn)行甲基化修飾[21].

3 DNA 甲基化在植物中的應(yīng)用

植物中的DNA 甲基化在植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中具有十分重要的調(diào)控作用，可發(fā)生在植物生長(zhǎng)的不同階段和組織中，不同程度的DNA 甲基化調(diào)節(jié)基因表達(dá)，導(dǎo)致植物發(fā)育和形態(tài)變異.

3.1 DNA 甲基化在植物中的作用

3.1.1 調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育 在植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育過程中，基因組中的DNA 甲基化和去甲基化共同作用確保植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育.不同時(shí)期和不同組織中都可發(fā)生DNA 甲基化水平的差異.隨著植物生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)間的延長(zhǎng)，組織和器官中會(huì)出現(xiàn)組織特異性，與其相關(guān)的特異性基因正常表達(dá)，而與組織特異性無關(guān)的基因則被滅活.

3.1.2 調(diào)控植物開花 植物進(jìn)行低溫處理與開花密不可分，通過低溫降低其基因組中DNA 甲基化水平，使開花基因表達(dá)，原因是低溫春化誘導(dǎo)開花相關(guān)基因去甲基化，當(dāng)去甲基化發(fā)生時(shí)，可調(diào)節(jié)一些開花相關(guān)基因的表達(dá).

3.1.3 植物衰老相關(guān) DNA 甲基化水平與植物衰老密切相關(guān).相關(guān)研究表明，植物基因組DNA 的甲基化狀態(tài)與衰老有關(guān)，尚不清楚這一因素是起主要作用還是控制植物衰老的原因之一，對(duì)植物不同生育期所對(duì)應(yīng)的DNA 甲基化水平的研究有可能揭示植物衰老、成熟與基因組DNA 甲基化程度之間的關(guān)系.

3.1.4 植物抵抗逆境 植物遭遇低溫、干旱、鹽堿和重金屬等逆境脅迫時(shí)，基因組DNA 甲基化可以維持植物基因組功能的穩(wěn)定性，防止逆境對(duì)植物功能基因表達(dá)的影響.

3.2 DNA 甲基化與牧草對(duì)不同逆境關(guān)系分析

DNA 甲基化對(duì)植物形態(tài)構(gòu)建和逆境環(huán)境的適應(yīng)起著關(guān)鍵作用，環(huán)境溫度回升或降低伴隨著DNA 甲基化水平的改變.隨著牧草生長(zhǎng)環(huán)境的改變，基因組DNA 甲基化水平發(fā)生不同變化，在表觀遺傳上表現(xiàn)出多態(tài)性.DNA 甲基化可控制基因表達(dá)，有利于提高植物對(duì)逆境環(huán)境的適應(yīng)能力.

3.2.1 鹽脅迫下牧草DNA 甲基化水平變化 在鹽脅迫下，導(dǎo)致苜?；蚪MDNA 甲基化水平產(chǎn)生不同的變化.Al-Lawati[13]等對(duì)鹽脅迫改變苜蓿DNA 甲基化水平進(jìn)行研究，用蒸餾水和NaCl 質(zhì)量濃度為0.0，5.6，8.4，14.0 g/L 灌溉植物1 周，采用MSAP 的方法測(cè)定紫花苜蓿根系中的胞嘧啶甲基化水平，結(jié)果顯示NaCl濃度增加了整體DNA 甲基化水平，特別是在高鹽度水平（14.0 g/L）的苜蓿中，由于甲基轉(zhuǎn)移酶同源基因受鹽分誘導(dǎo)過量表達(dá)所致.與此相反，Mahmoud W[12]等對(duì)模式植物蒺藜苜蓿響應(yīng)鹽脅迫的全基因組DNA 甲基化分析，將播種后9 周的蒺藜苜蓿植株用204 mmol 的NaCl 溶液灌溉植株1 周，對(duì)鹽脅迫處理下苜蓿根組織的DNA 樣本進(jìn)行差異全基因組亞硫酸氫鹽測(cè)序，約有5 000 萬個(gè)差異甲基化位點(diǎn)被識(shí)別，其中7%的位點(diǎn)隨著鹽度的變化而顯著改變，且基因組DNA 甲基化水平在鹽脅迫下呈降低趨勢(shì).

3.2.2 低溫脅迫下牧草DNA 甲基化水平變化 在低溫脅迫下，導(dǎo)致苜?；蚪MDNA 甲基化水平產(chǎn)生不同的變化.陳云[14]對(duì)12 份黃花苜蓿遺傳多樣性及6 份黃花苜蓿低溫條件下甲基化水平進(jìn)行分析，采用MSAP檢查分析技術(shù)，選擇多態(tài)性豐富和重復(fù)性比較好的10 對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，測(cè)試甲基化總帶數(shù)分別為130.75，154 條，全甲基化百分率平均為62.9%，76.5%，說明12 個(gè)苜蓿品種間甲基化模式存在一定差異，基因組甲基化水平高，反映了表觀遺傳修飾的物種差異，低溫脅迫提高了苜蓿基因組甲基化水平，其DNA 甲基化參與了苜蓿低溫脅迫的調(diào)控.孟德斌[17]等以8 個(gè)抗寒能力不同的紫花苜蓿品種為材料，對(duì)3 個(gè)時(shí)期（降溫前、降溫時(shí)和寒流后）的紫花苜蓿葉片采用HPLC 技術(shù)檢測(cè)DNA 甲基化水平，隨著溫度的降低，紫花苜?；蚪MDNA 甲基化水平升高；隨著溫度升高，甲基化水平先降低后升高，DNA 甲基化水平變化在13.02%～39.63%之間，不同品種基因組間DNA 甲基化水平存在差異，3 個(gè)時(shí)期紫花苜蓿甲基化水平在品種間未表現(xiàn)出差異，而是在時(shí)期因素下差異顯著，反映了紫花苜?？梢酝ㄟ^調(diào)節(jié)自身DNA 甲基化水平的升高來適應(yīng)溫度的提升.

3.2.3 干旱脅迫下牧草DNA 甲基化水平變化 在干旱脅迫下，導(dǎo)致黑麥草和老芒麥基因組DNA 甲基化水平產(chǎn)生不同變化.湯小梅[8]等采用MSAP 技術(shù)研究了干旱脅迫下多年生黑麥草DNA 甲基化的變化，在全基因組范圍內(nèi)，MSAP 共檢測(cè)到652 個(gè)CCGG 位點(diǎn)，對(duì)照組和干旱處理組的總甲基化水平分別為57.67%，47.39%，干旱脅迫降低了黑麥草總DNA 甲基化水平，甲基化程度與表達(dá)呈負(fù)相關(guān).DNA 甲基化在適應(yīng)干旱環(huán)境中發(fā)揮重要作用，誘導(dǎo)的基因組表觀遺傳變化在黑麥草適應(yīng)干旱環(huán)境中發(fā)揮重要的調(diào)控作用.陳云[14]對(duì)20 份老芒麥遺傳多樣性及2 份老芒麥干旱條件下甲基化水平進(jìn)行分析，采用MSAP 檢查分析技術(shù)，選擇多態(tài)性豐富和重復(fù)性比較好的15 對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，測(cè)試甲基化總帶數(shù)為376 條，占全甲基化百分率為79%，干旱脅迫4，6，8 d 的老芒麥總甲基化多態(tài)性分別為8.0%，14.4%，23.0%，說明老芒麥基因組DNA甲基化多態(tài)性水平隨干旱脅迫時(shí)間的增加而增加.

4 結(jié)語

DNA 甲基化是植物表觀遺傳的重要方式，在調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育、開花、衰老、抗性等過程中均發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用.逆境脅迫誘導(dǎo)的甲基化變化可參與牧草對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性調(diào)節(jié)，對(duì)于揭示牧草對(duì)逆境適應(yīng)機(jī)制、豐富牧草逆境育種理論具有重要指導(dǎo)意義.