艾中偉 李興江 董海影 明玥 沈博

【摘要】目的：探討甲狀腺乳頭狀癌患者中BRAF-V600E基因突變的表達(dá)情況。方法：選擇2015年1月-2020年12月期間齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院臨床病理診斷中心病理診斷為橋本氏甲狀腺炎并發(fā)甲狀腺乳頭狀癌（HT-PTC）、橋本氏甲狀腺炎（HT）以及甲狀腺乳頭狀癌（PTC）患者共135例為研究對(duì)象，均行BRAF V600E基因突變檢測(cè)，對(duì)BRAF V600E基因突變與HT-PTC臨床病理特征的關(guān)系進(jìn)行分析。結(jié)果：與PTC組和HT組相比，HT-PTC組的BRAF-V600E突變率較高，組間對(duì)比差異明顯（P<0.05），并且PTC組的BRAF-V600E突變率高于HT組（P<0.05）;HT-PTC組的PD-1/PD-L1、ERK、MEK以及KRT19陽性率均高于HT組和PTC組（P<0.05）;同時(shí)，BRAF V600基因突變與HT-PTC患者預(yù)后、腫瘤分期以及年齡有關(guān)（P<0.05），但是與發(fā)病部位、頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及腫瘤大小無關(guān)（P>0.05）。結(jié)論：BRAF V600E突變是女性橋本氏甲狀腺炎發(fā)生甲狀腺乳頭狀癌的一個(gè)重要誘因，并且與腫瘤分期和年齡有關(guān)，也是對(duì)HT-PTC患者預(yù)后進(jìn)行判斷的一個(gè)獨(dú)立因素。

【關(guān)鍵詞】甲狀腺乳頭狀癌;BRAF-V600E基因突變;橋本氏甲狀腺炎;病理特征

甲狀腺乳頭狀癌（PTC）是比較常見的一種內(nèi)分泌惡性腫瘤，其預(yù)后較好，術(shù)后10年生存率超過90%，但是一些PTC具有較強(qiáng)的侵襲性，容易出現(xiàn)轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，不僅影響患者預(yù)后，也是導(dǎo)致患者死亡的一個(gè)重要原因。近年來，在關(guān)于甲狀腺癌的分子機(jī)制研究中，發(fā)現(xiàn)鼠類肉瘤濾過性毒菌（v-Raf）致癌同源體B1（BRAF）基因突變是比較重要的一個(gè)因素，BRAF-V600基因突變?cè)赑TC患者中的發(fā)生率為28%-83%，但是在甲狀腺良性病變組織和正常組織中均未出現(xiàn)。有文獻(xiàn)報(bào)道，PTC患者同時(shí)往往伴有橋本氏甲狀腺炎（HT），因此明確橋本氏甲狀腺炎與甲狀腺乳頭狀癌的關(guān)系，確定橋本氏甲狀腺炎是乳頭狀癌的原因，還是結(jié)果，對(duì)于甲狀腺乳頭癌的預(yù)防、診斷和治療具有重要意義。因此，本文探討了BRAF V600E基因突變與橋本氏甲狀腺炎-甲狀腺乳頭狀癌臨床病理特征的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)告如下。

資料和方法

1.1一般資料

選擇2015年1月-2020年12月期間齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院臨床病理診斷中心病理診斷為橋本氏甲狀腺炎并發(fā)甲狀腺乳頭狀癌（HT-PTC）、橋本氏甲狀腺炎（HT）以及甲狀腺乳頭狀癌（PTC）患者共135例為研究對(duì)象，年齡22-78歲，平均（49.5±8.4）歲，其中55例為HT，40例為PTC，40例為HT-PTC。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）臨床資料完善，且行BRAF-V600E基因檢測(cè);（2）腫瘤直徑大小合適;（3）無其他癌癥病史及放療或化療史，無吸煙史;（4）術(shù)后病理診斷明確;（5）無甲狀腺、頸部淋巴結(jié)病史。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）病理診斷不明確，或者未行頸淋巴結(jié)清掃術(shù);（2）未行BRAF-V600E基因檢測(cè);（3）腫瘤直徑過大，不能明確其準(zhǔn)確位置;（4）合并其他惡性腫瘤;（5）吸煙史、頭頸部化療以及放療史;（6）甲狀腺或頸部淋巴結(jié)病史。

1.2方法

1.2.1實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)

運(yùn)用經(jīng)典Trizol-氯仿法提取組織總RNA，瓊脂糖電泳檢測(cè)RNA完整性，紫外分光光度法測(cè)定RNA的濃度及純度。取1μg總RNA，在20μL反應(yīng)體系中用oligo（d）T引物和SuperScriptⅡ逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得cDNA產(chǎn)物。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫提供的相應(yīng)基因cDNA序列，用Primer Express Software v2.0設(shè)計(jì)特異SYBR Green Real-time PCR引物。以cDNA作為模板，在ABI 7000熒光定量PCR儀上的96孔板中用SYBR Green嵌合熒光法進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。mRNA相對(duì)表達(dá)水平計(jì)算公式為2-△△CT，其中△△CT=（CT目的基因- CT看家基因）實(shí)驗(yàn)組-（CT目的基因- CT看家基因）對(duì)照組。

1.2.2檢測(cè)KRT19蛋白表達(dá)

運(yùn)用Western blot分析KRT19蛋白表達(dá)。采用蛋白提取試劑盒分別提取組織蛋白。將提取蛋白加200μL上樣緩沖液，煮沸10 min，室溫放置20 min溶解沉淀，置-80℃保存?zhèn)溆?。用BCA法檢測(cè)樣品蛋白質(zhì)濃度后，取50μg蛋白質(zhì)經(jīng)10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳2h分離。膠中蛋白質(zhì)在70mA恒流狀態(tài)下4℃過夜電泳轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。膜在5%脫脂奶粉37℃封閉2h。將兔抗小鼠一抗與硝酸纖維素膜4℃培育過夜。與辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG 37℃溫預(yù)1h。用Western印跡熒光發(fā)光檢測(cè)試劑盒發(fā)光、壓片，應(yīng)用凝膠成像分析系統(tǒng)分析測(cè)定各組條帶的積分光密度。同時(shí)，檢測(cè)KRT19 mRNA，方法與上述基本一致。

1.2.3檢測(cè)PD-1/PD-L1表達(dá)水平

借助免疫組化（SP三步法）染色法對(duì)腫瘤與黏膜組織內(nèi)PD-L1表達(dá)水平進(jìn)行測(cè)定。每次進(jìn)行免疫組化時(shí)均用 PBS 代替一抗作陰性對(duì)照，以排除非特異性結(jié)合。37℃溫水展片，1%多聚賴氨酸涂片，自然干燥，組織切片覆片，6℃烤片過夜，經(jīng)二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各 10min，無水乙醇及 95%、85%、75%乙醇各2min 浸泡后，自來水沖洗 2～3min，微波高火抗原修復(fù)，孵育 10min，封閉，加一抗和二抗，滴加 HRP 標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，封片，拍照。

1.2.4檢測(cè)MEK/ERK表達(dá)

采用實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot檢測(cè)MEK和ERK的表達(dá)，方法同上。同時(shí)采用免疫熒光法檢測(cè)MEK/ERK蛋白表達(dá)及磷酸化水平。組織塊放入液氮罐內(nèi)速凍5min，將其取出后應(yīng)用冰凍切片機(jī)進(jìn)行冰凍切片，片厚20μm，切片經(jīng)0.01M PBS清洗，與一抗4℃孵育過夜，0.01M PBS清洗，F(xiàn)ITC標(biāo)記熒光二抗1：1000，避光孵育1.5h，甘油封片。在熒光顯微鏡和圖像處理系統(tǒng)上進(jìn)行熒光顯微成像。應(yīng)用ImageJ軟件計(jì)算熒光強(qiáng)度。

1.3觀察指標(biāo)

統(tǒng)計(jì)三組的KRT19、MEK、ERK、PD-1/PD-L1以及BRAF-V600E陽性率，收集PTC的臨床病理學(xué)特征，包括腫瘤預(yù)后、發(fā)病部位、腫瘤分期、頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移區(qū)域、頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小以及年齡，并且分析BRAF-V600E突變與PTC病理學(xué)特征之間的相關(guān)性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

由SPSS20.0軟件分析，其中計(jì)數(shù)資料由百分率（%）表示，組間比較行X2檢驗(yàn)，運(yùn)用t檢驗(yàn)計(jì)量資料對(duì)比，以P<0.05表示有差異。

結(jié)果

2.1三組BRAF-V600E突變率比較

HT-PTC組、PTC組以及HT組的BRAF-V600E突變率分別為67.5%（27/40）、47.5%（19/40）、1.82%（1/55），組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.2三組MEK、ERK、PD-1/PD-L1以及KRT19陽性率對(duì)比

與PTC組和HT組相比，HT-PTC組的MEK、PD-1/PD-L1、KRT19以及ERK陽性率均較高，組間對(duì)比有差異（P<0.05），見表1。

2.3HT-PTC臨床病理學(xué)特征與BRAF V600基因突變之間的關(guān)系

BRAF V600基因突變與HT-PTC患者預(yù)后、腫瘤分期以及年齡有關(guān)（P<0.05），但是與發(fā)病部位、頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及腫瘤大小無關(guān)（P>0.05），見表2。

討論

PTC是比較常見的一種內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤，具有復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制，與基因突變、免疫功能紊亂以及內(nèi)分泌失調(diào)等諸多因素有關(guān)。有文獻(xiàn)報(bào)道，HT合并PTC具有較高的發(fā)病率，約為55%-60%，提示癌變的發(fā)生和發(fā)展與HT密切相關(guān)。HT作為自身免疫性的一種甲狀腺疾病，以體內(nèi)出現(xiàn)特異性甲狀腺抗體為主要表現(xiàn)，因?yàn)闈{細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤，可破壞甲狀腺組織結(jié)構(gòu)，從而降低甲狀腺功能。而BRAF基因是比較重要的一個(gè)原癌基因，位于人類7號(hào)染色體上，編碼RAF家族絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，也是MAPK/ERK信號(hào)通路的一個(gè)關(guān)鍵分子，與黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌、結(jié)腸癌以及PTC等有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，在甲狀腺其他腫瘤中，BRAF-V600E發(fā)生突變較少，僅出現(xiàn)在PTC中，提示BRAF-V600E基因突變是診斷PTC的一個(gè)特異性標(biāo)志物。也有文獻(xiàn)報(bào)道，PTC的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移以及侵襲性與BRAF-V600E位點(diǎn)的突變有關(guān)，不僅能夠誘發(fā)正常的甲狀腺濾泡細(xì)胞腫瘤，還可以促進(jìn)和維持PTC的侵襲性。在本次研究中，HT-PTC的BRAF V600E突變率高于PTC組和HT組（P<0.05），其中HT組中僅有1例突變，與國內(nèi)外研究報(bào)道基本一致，說明HT是否出現(xiàn)癌變與BRAF-V600E突變有關(guān)，并且BRAF-V600E也是導(dǎo)致HT癌變的一個(gè)重要危險(xiǎn)因素。同時(shí)，BRAF V600基因突變與HT-PTC患者預(yù)后、腫瘤分期以及年齡有關(guān)，提示這一基因位點(diǎn)不僅有助于鑒別甲狀腺良惡性腫瘤，還能判斷患者預(yù)后。

綜上所述，BRAF V600E突變是女性橋本氏甲狀腺炎發(fā)生甲狀腺乳頭狀癌的一個(gè)重要誘因，并且與腫瘤分期和年齡有關(guān)，也是對(duì)HT-PTC患者預(yù)后進(jìn)行判斷的一個(gè)獨(dú)立因素。

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