馬嘉晗，李海紅，王 玥，馮曌卓

(西安工程大學 環(huán)境與化學工程學院，陜西 西安 710048)

0 引 言

鹽度的變化能引起微生物群落及代謝途徑的顯著變化[1-2]，適量的無機鹽不僅能促進微生物生長過程中的酶反應[3]，而且能夠維持膜平衡、調(diào)節(jié)滲透壓。但無機鹽一旦過量會影響微生物的活性，高滲透壓環(huán)境會引起細胞質(zhì)壁分離，破壞細胞膜和酶系統(tǒng)，或作用于細胞表面使其性質(zhì)發(fā)生轉變，高鹽度對微生物的負面作用進而影響了生物反應器的處理性能[4-12]。印染廢水中含有大量有毒有色物質(zhì)，具有化學需氧量(COD)含量高、可生化性差、成分復雜等特點，屬于典型的高鹽廢水，會降低水體的透明度并消耗其中的溶解氧(DO)，影響水生生物的生長，同時降低水體自凈能力，破壞水體環(huán)境生態(tài)平衡，是全世界公認的最難處理的有機廢水之一[13-15]，用常規(guī)的物理和化學方法難以處理。而生物處理法因其操作簡單、耗能低、環(huán)境友好等優(yōu)勢成為修復印染廢水的主要方法。由于微生物對極端環(huán)境具有較強的適應能力，能夠迅速繁殖，在印染廢水的生物處理中應用廣泛[16-19]。

利用吸水鏈霉菌降解染料RB-B發(fā)現(xiàn),該菌種對染料RB-B去除率高達95.27%[20]。通過微生物菌群的水解酸化作用降解含有偶氮染料RB5和RBBR的模擬印染廢水，發(fā)現(xiàn)對2種染料的去除率均為90%，COD去除率為90%[21]。用毛皮染色廢水處理活性污泥與原始污泥相比，厚壁菌門成為了絕對優(yōu)勢菌門(48.31%)，藍細菌門的比例也有一定的增加，而擬桿菌門比例降低較多[22]。因此，染料對微生物群落有一定的選擇性，細菌和真菌對多種穩(wěn)定性較強的染料均具有較高的降解和礦化效率。本文探究不同鹽度和染料質(zhì)量濃度對活性污泥性能和菌群組成的影響，通過微生物群落的變化分析活性污泥對印染廢水的自適應機制。

1 實 驗

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料

取西安市某高校污水處理站回流污泥，在不同鹽度和染料質(zhì)量濃度下進行馴化篩選；按照碳氮磷比200∶5∶1的比例配制模擬廢水，并控制廢水NaCl質(zhì)量濃度在0～20 000 mg/L之間，高壓蒸汽滅菌后備用

1.1.2 試劑

葡萄糖(C6H12O6，天津市福晨化學試劑廠)；氯化鈉(NaCl，天津市大茂化學試劑廠)；磷酸氫二甲(K2HPO4，天津市科密歐化學試劑有限公司)；氯化銨(NH4Cl，成都市科隆化學品有限公司)；氫氧化鈉(NaOH，鄭州派尼化學試劑廠)，以上均為分析純。中性深黃GL(天津希恩思生化科技有限公司，優(yōu)級純) ；細菌基因組DNA試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)。

1.1.3 儀器

水浴恒溫振蕩器(SHA-C，常州德歐儀器制造有限公司)；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(DF-101S，鄭州市長城科工貿(mào)有限公司)；紫外分光光度計(UV-1800，上海美普達儀器有限公司)；溶解氧儀(JPB607A，(雷磁)儀電科學儀器股份有限公司)；Ph計(PHS-3C，(雷磁)儀電科學儀器股份有限公司)；COD快速測定儀(5B-3C，北京連華永興科技發(fā)展有限公司)；消解儀(5B-1F，北京連華永興科技發(fā)展有限公司)；氨氮快速測定儀(5B-6D(V8)，北京連華永興科技發(fā)展有限公司)；PCR儀(ABI GeneAmp?9700型,佰樂生命醫(yī)學產(chǎn)品有限公司)；Miseq PE300平臺(Illumina公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 耐鹽活性污泥馴化

1.2.2 模擬印染廢水處理效果測定

1.2.3 活性污泥中的微生物群落分析

利用16S-rDNA分析不同鹽度及染料質(zhì)量濃度條件下菌群結構的變化。耐鹽菌群基因組采用細菌基因組DNA試劑盒提取，使用Miseq PE300平臺進行高通量測序并構建測序文庫，將測序序列與通過 BLAST 檢索 GenBank 中的核酸序列進行同源性比對，確定微生物分類地位并進行生物信息學分析。

2 結果與分析

2.1 活性污泥處理廢水效率

(a) 1#反應器 (b) 2#反應器圖 1 2種反應器中及染料降解趨勢Fig.1 Degradation trends of and dyes in two reactors

2.2 菌落變化

基于Ace算法對不同微生物樣品間的Alpha多樣性進行分析，Ace算法下的各樣本OTU結果如圖2所示。

圖 2 Ace 算法下的各樣本OTU值Fig.2 OTUs of each sample with ACE algorithm

從圖2可以看出，隨著鹽度和染料質(zhì)量濃度的增加，微生物群落的生長受到不同程度的抑制，致使微生物多樣性逐漸降低。馴化開始前，Y0R0樣本OTU值為1 552，反應結束后，1號反應器馴化末期Y2R0及2號反應器馴化末期Y2R8樣本OTU值分別為馴化前的63.3%和59.8%，表明微生物群落的多樣性明顯下降；Y0R0、Y1R0、Y2R0樣本的OTU值與鹽度呈負相關，說明鹽度的提升對微生物種群具有較強的選擇性，不能適應含鹽環(huán)境的微生物隨著鹽度升高而被淘汰。同時，Y1R0的OTU值高于Y1R4，而Y2R0的OTU值也高于Y2R8，表明在同等鹽度條件下，添加染料使得污水中有機物等大分子物質(zhì)的增加對微生物生長產(chǎn)生脅迫作用，同樣降低了反應體系中的微生物多樣性。2個反應器中5個樣本的Venn圖比較分析如圖3所示。

圖 3 5個馴化污泥樣本之間微生物種群的相似性Fig.3 Microbial population similarity between five domesticated sludge samples

1、2號反應器各自的細菌群落結構的Venn圖如圖3右側所示，收集于1號反應器的3組樣品OTU值為643，2號反應器的3組樣品OTU值為1 603。只提升鹽度的1號反應器形成的OTU值高于配合投加染料的2號反應器的相應值，說明與鹽度加染料協(xié)同馴化方式相比，僅提升鹽度對污泥微生物群落具有更強的選擇性。

5個樣品OTU值綜合分析結果(圖3左側)，Y2R0、Y2R8的微生物種群OTU值分別為772、673，其中有400個OTU在所有污泥樣本均能找到。雖然每個樣本均含有部分獨有的微生物種群，但所有馴化階段共有的OTU值分別占到Y2R0、Y2R8樣本微生物種群OTU值的51.81%和59.44%，占馴化初期污泥樣本Y0R0微生物種群的27%。說明通過提升模擬廢水鹽度和染料質(zhì)量濃度對污泥進行馴化并未導致其中微生物種群發(fā)生突變，而少數(shù)共有微生物種群經(jīng)鹽度和染料脅迫存活下來。

2.3 活性污泥中優(yōu)勢菌群

5個不同階段污泥樣本的種群發(fā)生進化樹如圖4所示。

圖 4 科水平下的種群聚類Fig.4 Hierarchical clustering tree on family level

從圖4左側可以看出，5個樣本間具有一定的親緣關系，樣本Y0R0在進化樹中處于中間位置，而在馴化過程的前一階段，Y1R0與Y1R4的微生物種群的相似度極高，屬于同一個較小分支。隨著反應系統(tǒng)鹽度提升至2.0%，微生物種群組成明顯改變，但由于染料的添加，Y2R0和Y2R8產(chǎn)生了親緣度差異。說明隨著鹽度和染料質(zhì)量濃度的提升，微生物種群不斷發(fā)生變化；不同鹽度環(huán)境下的微生物種群的親緣度變得疏遠，但并未改變污泥中的優(yōu)勢微生物種群；而染料的投加對污泥中的微生物具有較強的選擇性。

從圖4右側可以看出，僅在反應系統(tǒng)中增加鹽度的條件下，Saccharimonadaceae和norank_o_C10_SB1A兩科菌含量均有不同程度的提高，并且Saccharimonadaceae成為優(yōu)勢菌群。norank_o_C10_SB1A、Caldilineaceae含量呈下降趨勢；在鹽度和染料質(zhì)量濃度協(xié)同作用下，Propionibacteriaceae含量明顯提高。經(jīng)鑒定，Propionibacteriaceae為革蘭氏陽性菌，其細胞壁較厚，肽聚糖含量豐富，并且含有大量的磷壁酸，可以抵抗較高的鹽度沖擊[23]，因此Propionibacteriaceae是高鹽度和高質(zhì)量濃度染料脅迫下的優(yōu)勢菌種。

為了更清楚地展示屬水平下豐度較高種群的變化規(guī)律，繪制了5個樣本在屬種類下的Heatmap圖(圖5)。從圖5可以看出，橫坐標為不同鹽度及染料質(zhì)量濃度下的5個樣本名稱，縱坐標為屬水平下豐度排序前10的物種。顏色從藍色到紅色漸變表示物種的豐度由小到大。橫向對比發(fā)現(xiàn)，親緣度較近的norank_o_PeM15和Candiidatus_Competibacter在5個樣本中的豐度都較高，且未見明顯變化趨勢，說明其對鹽度及染料質(zhì)量濃度有一定的耐受能力，可以作為優(yōu)勢菌群處理耐鹽印染廢水；norank_f_Saccharimonadaceae在Y1R0、Y2R0 2個樣本中豐度最高，在Y1R4、Y2R8 2個樣本中豐度較低，表明該兩屬菌株能在鹽度增長時能正常生長，但并不耐受染料馴化；Tessaracoccus在添加染料的樣本中Y1R4、Y2R8豐度較高，說明該種群是無機鹽和染料協(xié)同作用下的優(yōu)勢菌群，同時左側的系統(tǒng)發(fā)育表明，該屬與剩余的種群親緣關系較遠?？v向對比可以看出，Y1R0樣本中10種物種的豐度都較高，而在Y2R8樣本中，除Tessaracoccus、norank_o_PeM15、Candiidatus_Competibacter外，物種豐度明顯降低，進一步說明鹽度和染料質(zhì)量濃度對微生物群落的選擇性。

圖 5 在屬分類單元下的Heatmap圖Fig.5 Heatmap under the genus taxon

3 結 論

1) 鹽度和染料質(zhì)量濃度對微生物有較強的選擇性，不同馴化條件下的微生物群落組成差別較大，反應器中多數(shù)微生物并不能適應高鹽度和染料質(zhì)量濃度環(huán)境，僅有少數(shù)微生物適應并存活。

3) 活性污泥中微生物群落的多樣性由于鹽度和染料質(zhì)量濃度的增加而顯著減小，種群親緣關系也因二者的提升而疏遠。在鹽度和染料質(zhì)量濃度協(xié)作用下活性污泥中的優(yōu)勢菌屬為Tessaracoccus和norank_f_Saccharimonadaceae。