呂曉楠，徐立蒲，張 文，王 娜，曹 歡，王小亮，王 姝，王靜波

(1.北京市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，北京 100176；2.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100176)

鯉是全球養(yǎng)殖最廣泛的魚類，也是水產(chǎn)養(yǎng)殖中最具經(jīng)濟(jì)價(jià)值的品種之一。中國(guó)是鯉養(yǎng)殖大國(guó)，2019年其養(yǎng)殖產(chǎn)量約300萬(wàn)t[1]。錦鯉為鯉的變種，在中國(guó)同樣具有重要的市場(chǎng)價(jià)值[2]。近十年來(lái)，在中國(guó)多地鯉、錦鯉養(yǎng)殖場(chǎng)暴發(fā)一種新發(fā)重大流行疫病—鯉浮腫病(Carp edema virus disease，CEVD)，部分地區(qū)發(fā)病率高達(dá)50%，死亡率為50%～90%[3-6]。因缺乏有效防控措施，嚴(yán)重影響中國(guó)鯉、錦鯉養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。

鯉浮腫病是由鯉浮腫病毒(Carp edema virus，CEV)感染鯉科魚類引起的一種高度傳染性流行病毒病[7-8]?；疾◆~出現(xiàn)爛鰓、凹眼、昏睡等臨床癥狀并急性死亡。鯉浮腫病于1970年首次在日本錦鯉中發(fā)現(xiàn)并很長(zhǎng)一段時(shí)間僅在日本流行，后擴(kuò)散到英國(guó)、德國(guó)、荷蘭、意大利、美國(guó)等國(guó)家，中國(guó)于2016年首次報(bào)道了鯉浮腫病發(fā)生，目前國(guó)內(nèi)主要流行的基因型為Ⅱa基因型[3-8]。該病發(fā)現(xiàn)的時(shí)間較短，易感宿主細(xì)胞和全基因組序列等基礎(chǔ)研究相對(duì)落后，使得人們對(duì)CEV的易感宿主、流行病學(xué)和發(fā)病機(jī)制等認(rèn)識(shí)尚淺。至今有關(guān)CEV的生物學(xué)和流行病學(xué)特性還有許多未解之謎，各國(guó)學(xué)者都在研究當(dāng)中。CEV主要檢測(cè)方法是根據(jù)典型癥狀進(jìn)行初步診斷，再通過(guò)套式PCR或?qū)崟r(shí)熒光定量PCR確診[9-10]，原位雜交、免疫組織化學(xué)、免疫熒光、ELISA等診斷方法仍處于空白階段[8,11-13]。

目前，免疫組織化學(xué)和原位雜交技術(shù)已在人類、畜牧疾病檢測(cè)及診斷廣泛應(yīng)用。近幾年也逐漸應(yīng)用在水生動(dòng)物疾病的診斷上，為疾病防治奠定了基礎(chǔ)。李嘉波等[14]采用免疫組織化學(xué)檢測(cè)人工感染羅非魚湖病毒 (TiLV) 的吉富羅非魚肝臟、脾臟、頭腎、體腎、腦和鰓組織，發(fā)現(xiàn)病毒在所有組織中均有分布，其中脾臟、頭腎和鰓中的病毒豐度高于肝臟、體腎和腦組織。檢測(cè)人工感染傳染性胰臟壞死癥病毒 (IPNV) 的庸鰈(Hippoglossushippoglossus)卵黃囊仔魚，在腸、肝臟和腎臟均有病毒存在，靶位點(diǎn)是感染細(xì)胞的胞質(zhì)[15]。目前鮮有對(duì)鯉浮腫病病理變化進(jìn)行原位雜交、免疫組織化學(xué)確定CEV在病魚體內(nèi)的分布的相關(guān)研究報(bào)道。本研究通過(guò)對(duì)患病鏡鯉爛鰓、眼球凹陷的臨床癥狀觀察，同時(shí)采用組織病理學(xué)(HE染色)、免疫組織化學(xué)、原位雜交等多種方法系統(tǒng)地對(duì)發(fā)病鏡鯉的7種組織部位進(jìn)行病理變化和CEV感染的分布研究，并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)各組織中的CEV含量進(jìn)行測(cè)定，以確定CEV在病魚體內(nèi)的分布，以期為今后進(jìn)一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 2020年5月下旬河北省唐山市玉田縣某養(yǎng)殖場(chǎng)鏡鯉發(fā)生大面積死亡，累積死亡率高達(dá)80%以上。經(jīng)現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查，發(fā)病魚行動(dòng)遲緩，呈昏睡癥狀，疑似感染鯉浮腫病，故收集瀕死鏡鯉(感染組)作為研究樣本。健康鏡鯉(對(duì)照組)經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)證明其無(wú)CEV、鯉春病毒血癥(Spring viremia of carp virus，SVCV)、錦鯉皰疹病毒(Koi herpesvirus，KHV)感染。

1.1.2 主要試劑及儀器 DNA抽提試劑盒購(gòu)自QIAGEN公司；DNA擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；即用型DAPI染液購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；HE染色液和Scott藍(lán)化液均購(gòu)自Solarbio公司；超凈高級(jí)封片膠購(gòu)自BASO公司；兔抗CEV一抗(CEV P4a片段)由北京市水產(chǎn)技術(shù)推廣站制備；蘇木素染液和HRP標(biāo)山羊抗兔IgG(H+L)均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；DAB顯色試劑盒、中性樹脂均購(gòu)自CWBIO公司；M199細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清(FBS)、牛血清白蛋白(BSA)均購(gòu)自Gibco公司。電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(HGZF-101-1)購(gòu)自上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；熱恒溫培養(yǎng)箱(DHP-9054)購(gòu)自山東博科生物有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(AB7500)購(gòu)自Life Technologies公司；光學(xué)顯微鏡(Axio Vert.A1)購(gòu)自Zessi公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 將疑似感染鯉浮腫病的瀕死鏡鯉現(xiàn)場(chǎng)剖檢，選取具有爛鰓、眼球凹陷等臨床癥狀明顯的病魚17尾。取7尾病魚，分別取心臟、肝臟、脾臟、腎臟、腦、皮膚、鰓，用4%多聚甲醛固定后石蠟包埋待用。剩余10尾病魚，分別取上述組織，每尾魚逐個(gè)組織制樣，制備方法是稱取0.5 g組織，充分勻漿后與500 μL含10% FBS的M199培養(yǎng)液混合，-20 ℃保存待測(cè)。

1.2.2 組織病理切片制備 取出用4%多聚甲醛固定的組織，用流水沖洗數(shù)小時(shí)，經(jīng)70%、80%、90%乙醇溶液脫水，純酒精、二甲苯等量混合液15 min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ各15 min，至透明為止。放入二甲苯和石蠟各半的混合液15 min，再放入石蠟Ⅰ、Ⅱ透蠟各50～60 min，最后用石蠟包埋、切片。將石蠟切片進(jìn)行烤片，然后脫蠟、水化。將水化后的切片放入蘇木精水溶液中染色3 min，鹽酸乙醇(0.5%)分化液分化15 s，水洗后用返藍(lán)液返藍(lán)15 s，流水沖洗，HE染色3 min，流水沖洗，脫水，透明，封片，正置顯微鏡觀察并拍照。

1.2.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè)CEV P4a蛋白的分布和表達(dá) 將組織切片放入65 ℃烤箱中烤2 h，然后在二甲苯中放置10 min，更換二甲苯再放置10 min。將切片依次放入100%乙醇、100%乙醇、95%乙醇、80%乙醇和純凈水中各5 min。將切片放入修復(fù)盒中，加入抗原修復(fù)液(檸檬酸緩沖液)，高壓鍋加熱到自動(dòng)放氣，2 min后離開熱源自然冷卻，棄抗原修復(fù)液，將切片用PBS淋洗。將切片移入濕盒中，加入新配制的3%雙氧水，以去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶封閉液，室溫孵育10 min，PBS充分淋洗。PBS浸洗切片3次，每次5 min，吸水紙吸干組織周圍的PBS，在玻片上滴加5% BSA，37 ℃封閉30 min。用吸水紙吸掉組織周圍的封閉液，每張切片滴加兔抗CEV一抗(1∶200)，濕盒中4 ℃孵育過(guò)夜。取出4 ℃孵育過(guò)夜?jié)窈?，室溫靜置45 min，PBS浸洗切片3次，每次5 min，滴加HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)(1∶200)，37 ℃孵育30 min，PBS充分淋洗。DAB顯色5～10 min，在體視顯微鏡下觀察染色程度，PBS或自來(lái)水沖洗1 min。蘇木精復(fù)染3 min，1%鹽酸酒精分化，返藍(lán)；自來(lái)水沖洗1 min，脫水、透明、封片、光學(xué)顯微鏡觀察并采集圖像。

1.2.4 原位雜交檢測(cè)CEVP4a基因的分布及表達(dá) 根據(jù)原位雜交探針設(shè)計(jì)原則，以NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中CEVP4a基因序列(登錄號(hào)：MH645915.1、KX254001.1、KX254004.1、KX254003.1、KX253997.1)共同保守區(qū)域?yàn)榘形稽c(diǎn)，采用DNAMAN 6.0軟件進(jìn)行序列比對(duì)分析，選取同源性高的片段，設(shè)計(jì)3條探針，于5′-端標(biāo)記FAM。探針粉末5 000 r/min離心15 s，加入雜交液配制成探針，3條探針等量混合使用。探針序列如下：

Probe-1：5′-[FAM]+GCCCAAGAGTTTTC-TTCTCATCGTTTGTTACC-3′；

Probe-2：5′-[FAM]+GCAACTCCTTGAGG-AATATGATCTAGAATTCC-3′；

Probe-3：5′-[FAM]+GAACATAACATTTG-CAATTTTAACTTGCTCTGG-3′。

將制備好的石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，用PBS洗滌3次，每次5 min。先煮沸15 min，滴加蛋白酶K(20 μL/mL)室溫消化20 min，蒸餾水洗1次，PBS重復(fù)洗3次，每次5 min。隨后滴加適量預(yù)雜交液，置于42 ℃恒溫培養(yǎng)箱中2～3 h，吸去多余液體后，滴加適量雜交液，37 ℃恒溫過(guò)夜。37 ℃條件下經(jīng)梯度SSC洗滌(2×SSC洗滌10 min，1次；1×SSC洗滌10 min，2次；0.5×SSC洗滌10 min，1次)。滴加DAPI避光孵育5 min對(duì)標(biāo)本進(jìn)行染核，用PBS沖洗多余的DAPI。最后用50%甘油封片，通過(guò)熒光顯微鏡和圖像采集系統(tǒng)觀察并采集圖片。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)病毒載量 將1.2.1勻漿好的各組織液1 000 r/min離心10 min，取上清200 μL。采用DNA抽提試劑盒抽提樣品核酸，按照SC/T7229—2019[9]中實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法進(jìn)行鯉浮腫病毒檢測(cè)。 引物為qF1：5′-AGTT-TTGTAKATTGTAGCATTTCC-3′，qR1：5′-GA-TTCCTCAAGGAGTTDCAGTAAA-3′，熒光探針為：5′-FAMAGAGTTTGTTTCTTGCCATACAA-ACTBHQ1-3′，檢測(cè)中采用的引物及探針均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系：2×預(yù)混合液(2×Probe Master Mix) 10 μL，上、下游引物各0.8 μL，探針0.4 μL，模板2.5 μL，加ddH2O水至20 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性5 s，56 ℃退火31 s，共40個(gè)循環(huán)。組織的病毒載量按徐立蒲等[16]的方法計(jì)算。

病毒載量/(個(gè)/ng)=[(10(Ct值-38.73)/-3.3606×PCR反應(yīng)終體積20 μL/PCR體系加入的模板量2.5 μL)×抽提DNA終體積200 μL]/抽提核酸用組織量

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用SPSS 16.0對(duì)1.2.5各組織的病毒載量結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，并采用Fisher法進(jìn)行多重比較。結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 感染CEV鏡鯉各組織的病變情況

利用HE染色觀察發(fā)病鏡鯉心臟、肝臟、皮膚、脾臟、腎臟、腦、鰓7個(gè)組織的病理改變，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，與健康鏡鯉相比，患病鏡鯉心臟、皮膚、腦沒有明顯的病理變化；患病鏡鯉的肝臟細(xì)胞深染萎縮，膽小管出血(如箭頭所示)；健康魚的脾臟組織結(jié)構(gòu)完整，患病魚脾臟組織出現(xiàn)明顯間隙并伴有出血(如箭頭所示)；健康鏡鯉腎臟組織的腎小管結(jié)構(gòu)清晰，患病鏡鯉腎臟組織充血明顯，腎小管有明顯閉合現(xiàn)象(如箭頭所示)；健康鏡鯉鰓絲組織結(jié)構(gòu)清晰分明，未見腫脹斷裂等現(xiàn)象，患病鏡鯉可以看見鰓絲腫脹、充血，鰓絲間有脫落堆積的紅細(xì)胞和炎性細(xì)胞(如箭頭所示)。

2.2 CEV P4a蛋白在鏡鯉各組織中的表達(dá)情況

利用免疫組織化學(xué)檢測(cè)CEV在發(fā)病鏡鯉各組織的分布和蛋白表達(dá)情況，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，在健康鏡鯉組織未見CEV P4a蛋白表達(dá)，在患病鏡鯉的肝臟和鰓中可見CEV P4a蛋白大量表達(dá)，在心臟、脾臟、腎臟中少量表達(dá)。

2.3 CEV P4a核酸在鏡鯉各組織中的表達(dá)情況

利用原位雜交檢測(cè)CEVP4a基因在發(fā)病鏡鯉各組織中的分布和核酸表達(dá)量的變化，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，在健康鏡鯉各組織未見CEV P4a表達(dá)；在發(fā)病鏡鯉鰓組織中CEV P4a大量表達(dá)，皮膚、肝臟、脾臟和腎臟少量表達(dá)，心臟、腦幾乎不表達(dá)。

2.4 CEV P4a基因在鏡鯉各組織中的病毒載量

病毒載量結(jié)果分析表明，CEV在鰓組織中的載量極顯著高于在肝臟、腦、脾臟、腎臟、心臟、皮膚組織(P<0.01)，但肝臟、腦、脾臟、腎臟、心臟、皮膚組織之間的載量分布差異不顯著(P>0.05)(表1)。

3 討 論

目前，鯉浮腫病是危害鯉和錦鯉養(yǎng)殖業(yè)最為嚴(yán)重的動(dòng)物疫病之一，帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重阻礙了鯉科魚類養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[3-4,8,17-18]。據(jù)國(guó)內(nèi)外已有報(bào)道，其發(fā)病水溫范圍較廣，在7～27 ℃時(shí)均可發(fā)病[3-8,17-18]。對(duì)中國(guó)河南等地區(qū)以往發(fā)生鯉浮腫病養(yǎng)殖場(chǎng)的流行病學(xué)調(diào)查顯示，發(fā)病一般有2個(gè)高峰，5～6月和9月，這2個(gè)時(shí)間段養(yǎng)殖水溫為20～27 ℃[3]。本次發(fā)病的養(yǎng)殖場(chǎng)位于河北省唐山市玉田縣，發(fā)病時(shí)間為5月下旬，發(fā)病水溫為20～22 ℃，死亡率>80%，與之前的流行病學(xué)調(diào)查顯示的發(fā)病高峰時(shí)間和水溫相一致，提示養(yǎng)殖場(chǎng)特別是在鯉浮腫病發(fā)病高峰之際要做好預(yù)防措施。本次發(fā)病鏡鯉臨床癥狀與之前報(bào)道相似[3-4,7-8，17-20]，主要表現(xiàn)為行動(dòng)遲緩、有時(shí)呈昏睡狀、體表糜爛、出血、爛鰓、眼球凹陷等病癥。

組織病理學(xué)是研究病毒靶器官和靶細(xì)胞的第一步，同時(shí)也是研究病毒致病機(jī)理的基礎(chǔ)。目前關(guān)于CEV引起鯉的組織病理變化較多，但大多數(shù)只研究了鰓組織損傷，自然感染引起鯉的組織病理學(xué)觀察缺乏系統(tǒng)的比較研究。不同組織有不同的病理特征，本研究中鰓組織病理變化表現(xiàn)與前人研究結(jié)果一致[16,21]。在自然發(fā)病鏡鯉中，鰓作為CEV進(jìn)入宿主體內(nèi)的重要門戶，鰓組織充血、腫脹，鰓小片融合、增生，嚴(yán)重影響氣體交換，導(dǎo)致缺氧和鰓血液循環(huán)功能受阻，從而造成鏡鯉大量死亡。肝臟、脾臟和腎臟也有不同程度的損傷。肝臟是主要的代謝器官，參與污染物的生物轉(zhuǎn)化、脫氧、肝糖的儲(chǔ)存盒分泌蛋白的合成。脾臟作為血庫(kù)，還產(chǎn)生免疫球蛋白、補(bǔ)體和其他參與免疫功能的物質(zhì)。中腎清除有害代謝物，維持電解質(zhì)穩(wěn)態(tài)。頭腎是重要的造血器官和免疫器官，在這些組織中，CEV均可引起嚴(yán)重的空泡化和細(xì)胞壞死，導(dǎo)致機(jī)體腎臟和脾臟組織的免疫和造血功能減弱，同時(shí)削弱了肝臟的代謝功能和解毒能力，最終導(dǎo)致病毒大量擴(kuò)散和增殖。因此，推測(cè)CEV主要破壞血液循環(huán)系統(tǒng)和實(shí)質(zhì)器官，感染CEV的鏡鯉死于循環(huán)系統(tǒng)紊亂和多器官衰竭。

圖1 鏡鯉各組織的病變情況(HE，400×)Fig.1 The pathological changes in different tissues of mirror carps (HE，400×)

圖2 CEV P4a蛋白在鏡鯉各組織中的表達(dá)情況(400×)Fig.2 Expression of CEV P4a protein in different tissues of mirror carps (400×)

圖3 CEV P4a在鏡鯉各組織中核酸表達(dá)情況(400×)Fig.3 Expression of CEV P4a nucleic acid in different tissues of mirror carps (400×)

表1 感染鏡鯉各組織中CEV病毒載量

免疫組化可在對(duì)病毒性疾病進(jìn)行常規(guī)病理診斷的基礎(chǔ)上，在相應(yīng)組織原位對(duì)感染病毒做出特異、明確的定位診斷。原位雜交技術(shù)可檢測(cè)特定基因顯微或亞顯微水平的時(shí)空表達(dá)情況。本研究同時(shí)采用免疫組化和原位雜交的方法對(duì)鯉浮腫病自然感染鏡鯉的7個(gè)組織進(jìn)行研究，在國(guó)內(nèi)外均屬首次報(bào)道。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是蛋白水平還是核酸水平，鰓組織的P4a均呈現(xiàn)大量表達(dá)。推測(cè)在自然發(fā)病鏡鯉中，鰓作為CEV進(jìn)入宿主體內(nèi)的主要通道之一，鰓組織中病毒的存在也表明鏡鯉通過(guò)過(guò)濾和呼吸作用與水體進(jìn)行物質(zhì)交換，導(dǎo)致CEV感染鰓血管細(xì)胞后，在該細(xì)胞中增殖并釋放到血液中，進(jìn)而隨著血液循環(huán)感染脾臟、頭腎等免疫器官，導(dǎo)致疾病發(fā)生。此外，免疫組化結(jié)果表明，健康鏡鯉的腦、皮膚、心臟出現(xiàn)了一些非特異性的顯色信號(hào)，這提示采用的兔抗CEV多克隆抗體在特異性方面可能存在不足。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)表明，鰓組織病毒載量極顯著高于其他部分，這與徐立蒲等[16]研究結(jié)果一致。諸多證據(jù)均顯示鰓是鯉浮腫病攻擊的重要靶器官，為疫病監(jiān)測(cè)確定采樣部位提供基礎(chǔ)依據(jù)的同時(shí)，也闡明了感染CEV造成鏡鯉大面積死亡的直接原因。

疾病的發(fā)展是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過(guò)程，因此在不同時(shí)間、不同器官會(huì)先后遭到不同程度的攻擊而損傷。不同體質(zhì)的鏡鯉受到病毒不同強(qiáng)度的攻擊也會(huì)在不同時(shí)間和不同器官上出現(xiàn)不同程度的病理變化。本試驗(yàn)所展示的是鯉浮腫病發(fā)病動(dòng)態(tài)發(fā)展的一個(gè)截面，但即使是截面，也能從4種方法中得到同一個(gè)結(jié)論，即鰓的病理變化最大，病毒抗原和核酸量也最多。說(shuō)明鰓是CEV增殖的最主要靶器官。鰓絲末端細(xì)胞增生會(huì)嚴(yán)重影響到血液的氣體交換，導(dǎo)致魚缺氧、浮頭、反應(yīng)遲緩、代謝紊亂等，出現(xiàn)“浮腫”和“昏睡”的臨床癥狀，推測(cè)鰓組織的病理變化可能是導(dǎo)致鏡鯉缺氧死亡的主要原因。

在鰓組織的壞死部位病毒含量較高，說(shuō)明病毒能通過(guò)鰓絲進(jìn)入魚體并在鰓中復(fù)制，從而導(dǎo)致呼吸上皮細(xì)胞脫落和壞死，但如需進(jìn)一步了解鰓損傷的致病機(jī)制，仍需研究宿主與病毒在鰓中的相互作用。鰓絲上較高的病毒載量也說(shuō)明了CEV能通過(guò)鰓絲釋放到水中進(jìn)行傳播，這種方式能很好地解釋鯉浮腫病傳播速度快的特性。由于該病的危害極大，若防控不力則極有可能造成鯉浮腫病的進(jìn)一步擴(kuò)散和流行。

4 結(jié) 論

本研究確診唐山某養(yǎng)殖場(chǎng)鏡鯉發(fā)生大面積、急性死亡的病原為CEV，感染后鰓絲腫脹、充血，肝臟、脾臟等內(nèi)臟組織不同程度充血、出血，病毒主要分布在鰓組織。表明鰓是CEV增殖的最主要靶器官，結(jié)果可為鯉浮腫病診斷和防控提供參考。