王同兆，張付賢，雷連成,2

(1.長江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，荊州 434023；2.吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，長春 130062)

副豬嗜血桿菌病是由副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis,Hps)引發(fā)的、以豬多發(fā)性纖維素性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎為特征的全身感染性疾病，嚴(yán)重危害仔豬和青年豬的健康。Hps是一種條件致病菌，廣泛存在于豬的上呼吸道[1]，在豬遭受飼養(yǎng)管理不當(dāng)、天氣變化、長途運(yùn)輸?shù)葢?yīng)激條件時(shí)易引起發(fā)病。此外，當(dāng)豬感染其他疾病導(dǎo)致免疫力減退時(shí)，也易引起Hps感染，特別是在免疫抑制性疾病的作用下，導(dǎo)致豬群高發(fā)病率和高死亡率[2-3]。

已發(fā)現(xiàn)的Hps有15種血清型，其中血清1、2、3、4、5、8、10、12、13、14和15型具有較強(qiáng)的致病性，而血清4和5型在中國最流行[4]。Hps不同血清型或不同菌株間交叉保護(hù)力低，有明顯的地方特異性，不同地區(qū)分離的相同血清型菌株的毒力和抗原性可能不同[5]。由于臨床上濫用抗生素預(yù)防和治療副豬嗜血桿菌病，導(dǎo)致中國大部分省市Hps產(chǎn)生耐藥性[6]。目前，國內(nèi)外對Hps的報(bào)道越來越多，呈急驟上升趨勢。Hps單獨(dú)感染可導(dǎo)致豬群發(fā)病，臨床上發(fā)現(xiàn)其與多種細(xì)菌如多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida,Pm)、豬鏈球菌(Streptococcussuis,SS)、胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae,APP)等，與多種致病性病毒如豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)等多重混合感染[7-8]，是導(dǎo)致保育階段仔豬死亡率升高的主要原因，其在全球范圍內(nèi)廣泛流行與致病性、耐藥性的不斷加重嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)的健康發(fā)展，帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[9]。2020年12月，河南省漯河某豬場的仔豬暴發(fā)呼吸道疾病，經(jīng)抗生素治療后效果不顯著，病死豬剖檢可見胸腔積液、肺臟肉樣變、淋巴結(jié)腫大等癥狀。為了闡明引起此次仔豬呼吸道疾病的主要細(xì)菌性病原，采集2～3月齡具有典型呼吸道癥狀仔豬的口鼻拭子和病死豬的病變器官，通過病原菌的分離培養(yǎng)、染色觀察、衛(wèi)星試驗(yàn)、PCR等方法鑒定引起仔豬呼吸道癥狀的主要病原體為Hps，并對分離菌株的血清型、致病性和耐藥性等進(jìn)行了研究，以期為臨床上Hps感染的精準(zhǔn)施治和合理用藥提供理論依據(jù)，為有效防控Hps及其相關(guān)疾病提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料

采集河南省漯河某豬場2～3月齡、具有呼吸道癥狀仔豬的口鼻拭子60份；無菌采集病死豬的胸腔積液8份、淋巴結(jié)28份，以及病變肺臟、肝臟和脾臟共21份。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

30只體重為18～20 g的BALB/c小鼠，購自湖北宜昌三峽大學(xué)，Pm、SS、APP、Hps、PCV2、PRRSV等病原檢測均為陰性。

1.3 主要試劑

腦心浸液培養(yǎng)基(brain heart infusion,BHI)購自O(shè)xoid公司；特級馬血清、革蘭染色劑、瓊脂、D-氨基葡萄糖均購自北京索萊寶生物科技有限公司；Taq酶購自寶生物工程(大連)有限公司；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)購自Biofoxx公司；病毒DNA/RNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司；金黃色葡萄球菌CVCC 25923由河南科技學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。

1.4 呼吸道疾病病原的鑒定

1.4.1 病料核酸的提取 取送檢肺臟約300 mg，經(jīng)滅菌過的研磨器勻漿后用300 μL無菌PBS稀釋后轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，按照病毒基因組提取試劑盒操作說明提取病料的DNA/RNA，利用FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得的cDNA樣品于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 呼吸道疾病病原的PCR鑒定 以從病料中提取的DNA與反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，參照文獻(xiàn)[10-11]中引物(表1)，分別擴(kuò)增Pm、SS、APP、Hps、PCV2、PRRSV的特異性基因，PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 豬呼吸道病原檢測引物信息

1.5 細(xì)菌分離鑒定

1.5.1 病原分離培養(yǎng) 取病豬的胸腔積液、病變肺臟、肝臟和脾臟等組織，在超凈工作臺(tái)中分別接種于含5%馬血清、20 μg/mL NAD[12]的固體BHI培養(yǎng)基上進(jìn)行病原的分離培養(yǎng)，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h。

1.5.2 病原菌染色觀察 觀察培養(yǎng)基上生長細(xì)菌的菌落形態(tài)，挑取表面光滑、針尖大小的菌落進(jìn)行革蘭染色、鏡檢[13]。

1.5.3 衛(wèi)星試驗(yàn) 將分離并純化的菌種均勻劃線接種于綿羊血平板上，在平板的中心垂直劃線接種金黃色葡萄球菌CVCC 25923，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，觀察平板上菌落是否有衛(wèi)星菌落生長與溶血現(xiàn)象[14-15]。

1.5.4 V因子依賴性試驗(yàn) 將分離菌株純培養(yǎng)物分別接種BHI、BHI+5%馬血清、BHI+5%馬血清+20 μg/mL NAD的液體培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察培養(yǎng)基的渾濁度[16]。

1.5.5 PCR鑒定 利用Hps的鑒定引物vanY-F/R對有衛(wèi)星現(xiàn)象的菌落進(jìn)行PCR鑒定。PCR擴(kuò)增體系20 μL：模板1 μL，2×PCR Mix 10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，ddH2O 7 μL。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取5 μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，80 V恒壓電泳50 min。

1.5.6 16S rDNA鑒定 利用通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′與1492R：5′-TACGCTACCTTGTTACGACTT-3′進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系20 μL：模板1 μL，2×PCR Mix 10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，ddH2O 7 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司武漢測序部進(jìn)行測序；利用NCBI BLAST工具對測序結(jié)果進(jìn)行比對分析，并用Mega-X工具構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.5.7 Hps血清型分型 參照Howell等[17]引物對分離菌株進(jìn)行多重PCR鑒定，引物序列見表2。PCR擴(kuò)增體系20 μL：模板1 μL，2×PCR Mix 10 μL，引物Mix(50 μmol/L)3 μL，ddH2O 6 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，80 V恒壓電泳50 min。

表2 Hps分型引物信息

1.6 動(dòng)物致病性試驗(yàn)

將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的Hps以無菌PBS重懸至終濃度分別為4.2×1012、4.2×1011、4.2×1010、4.2×109及4.2×108CFU/mL；將30只BALB/c小鼠隨機(jī)分為6組，每組5只，其中5個(gè)感染組分別腹腔注射不同稀釋度的Hps 0.2 mL，對照組注射同體積的無菌PBS。觀察各組小鼠的臨床癥狀，并對死亡小鼠進(jìn)行剖檢。采集死亡小鼠的血液、心臟、腦、脾臟、肺臟、腎臟、肝臟及腹水等樣品，在固體BHI培養(yǎng)基上劃線分離，并對分離到的菌落進(jìn)行PCR鑒定。

1.7 分離菌株的藥敏試驗(yàn)

用無菌接種環(huán)挑取單菌落接種于含5%馬血清、20 μg/mL NAD的BHI液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)5～6 h，用無菌棉簽蘸取菌液均勻涂布于平板上。采用Kirby-Bauer(K-B)紙片擴(kuò)散法[18]，選取四環(huán)素、環(huán)丙沙星等11種抗菌藥為試驗(yàn)藥物，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈直徑，并參考流感嗜血桿菌NCTC 8468與ATCC 49766的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)判定Hps的耐藥性。

2 結(jié) 果

2.1 呼吸道疾病病原的鑒定結(jié)果

從采集的病料中提取DNA/RNA，以提取的DNA與反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進(jìn)行呼吸道疾病病原的PCR鑒定，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳顯示，泳道8有約302 bp的條帶，與Hps陽性對照大小一致(圖1)；其他病原檢測均為陰性，推測該豬場仔豬的呼吸道疾病可能由Hps感染造成。

2.2 致病菌分離鑒定

2.2.1 致病菌培養(yǎng)特性 將病料劃線接種于含血清和NAD的BHI固體平板后，生長出無色透明、表面光滑的微小菌落(圖2A)；純培養(yǎng)的細(xì)菌革蘭染色形態(tài)為革蘭陰性桿菌，多單個(gè)存在，呈球桿、長桿狀，部分以短鏈排列成絲狀分布(圖2B)，符合Hps的基本形態(tài)特征。

2.2.2 衛(wèi)星試驗(yàn) 將金黃色葡萄球菌與分離菌株垂直劃線接種于綿羊血平板，培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)分離菌株只生長在金黃色葡萄球菌培養(yǎng)物周圍，越靠近金黃色葡萄球菌的分離菌株，生長狀態(tài)越好，呈現(xiàn)典型的“衛(wèi)星現(xiàn)象”，且未發(fā)現(xiàn)溶血活性(圖2C)。

M，DL2000 DNA Marker；1，Hps陰性對照；2～7，Hps、APP、SS、Pm、PRRSV、PCV2陽性對照；8～13，樣品Hps、APP、SS、Pm、PRRSV、PCV2病原檢測M,DL2000 DNA Marker;1,Hps negative control;2-7,Hps,APP,Pm,PRRSV and PCV2 positive control，respectively;8-13,Sample pathogen detection of Hps,APP,SS,Pm,PRRSV and PCV2，respectively圖1 病料的PCR鑒定Fig.1 PCR identification of the sample

A，分離菌株菌落形態(tài)；B，分離菌株革蘭染色(1 000×)；C，分離菌株的衛(wèi)星現(xiàn)象A,Colony morphology of the isolated strains;B,Gram staining of the isolated strains(1 000×);C,Satellite phenomenon of the isolated strains圖2 分離菌株形態(tài)學(xué)鑒定Fig.2 Morphological identification of the isolates

2.2.3 V因子依賴性試驗(yàn) 將分離菌株的純培養(yǎng)物分別接種BHI、BHI+5%馬血清、BHI+5%馬血清+20 μg/mL NAD的液體培養(yǎng)基，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分離菌株在不含V因子的BHI和BHI+5%馬血清培養(yǎng)基中不生長，而在含有V因子的培養(yǎng)基中大量增殖(圖3A)，說明該分離菌的生長依賴V因子。

2.2.4 PCR鑒定 利用Hps的特異性引物對有衛(wèi)星現(xiàn)象與V因子依賴的菌落進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果顯示，從分離菌基因組DNA中擴(kuò)增出302 bp的特異性條帶(圖3B)，與預(yù)期大小相符，說明分離菌株為Hps。

2.2.5 16S rDNA基因序列分析 以分離菌株DNA為模板，利用通用引物27F、1492R擴(kuò)增分離菌株的16S rDNA并進(jìn)行測序，測序結(jié)果比對發(fā)現(xiàn)，分離菌株序列與GenBank中收錄的Hps參考株基因序列的相似性為97%～98%。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，分離菌株與Hps P462/03株處于同一分支(圖4),證實(shí)分離菌株為Hps，命名為LH-20201220。

1，BHI；2，BHI+5%馬血清；3，BHI+5%馬血清+20 μg/mL NAD；M，DL2000 DNA Marker；4，陽性對照；5，分離菌株1,BHI；2，BHI+5% horse serum；3，BHI+5% horse serum +20 μg/mL NAD；M，DL2000 DNA Marker；4,Positive control;5，Isolates圖3 V因子依賴性試驗(yàn)(A)與PCR鑒定(B)結(jié)果Fig.3 Results of V factor dependent test (A) and PCR identification (B)

圖4 分離菌株16S rDNA序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree of 16S rDNA sequence of the isolate

2.2.6 分離菌血清型鑒定 利用Hps血清分型引物對分離菌LH-20201220進(jìn)行多重PCR鑒定，結(jié)果顯示，在約320 bp處擴(kuò)增出清晰的特異性條帶(圖5A)，與血清4型陽性對照大小相符；以血清4型特異性引物對分離菌LH-20201220的亞型進(jìn)行重復(fù)鑒定，結(jié)果顯示，在約320 bp處出現(xiàn)特異性條帶(圖5B)，與多重PCR鑒定結(jié)果一致，確定分離菌LH-20201220為Hps血清4型菌株。

①A，多重PCR鑒定；B，血清4型PCR鑒定。②M，DL2000 DNA Marker；1～3，分離菌株；4，陽性對照①A，Multiple PCR identification;B，Identification of serotype 4.②M,DL2000 DNA Marker;1-3,Isolates;4,Positive control圖5 分離株血清型鑒定Fig.5 Serotype identification of the isolate

2.3 分離菌株的致病性試驗(yàn)

將純培養(yǎng)的分離菌株LH-20201220分別腹腔注射試驗(yàn)組小鼠，在感染后2 h，試驗(yàn)組小鼠均出現(xiàn)被毛凌亂、呼吸急促、扎堆畏寒等癥狀，對照組小鼠未出現(xiàn)異常變化；在感染后8 h，4.2×1012和4.2×1011CFU/mL組小鼠全部死亡，4.2×1010、4.2×109及4.2×108CFU/mL組小鼠活動(dòng)性降低、厭食、呼吸急促、被毛凌亂無光澤；在感染后72 h，4.2×

1010、4.2×109及4.2×108CFU/mL組小鼠的臨床癥狀有所緩解，5 d后基本恢復(fù)正常。

剖檢死亡小鼠發(fā)現(xiàn)，感染Hps小鼠的肺臟、肝臟、脾臟、心臟和腦組織均有不同程度出血，以肺臟最為明顯；腸壁變薄、透明，局部有出血。無菌采集死亡小鼠的心臟、腦、脾臟、肺臟、腎臟、肝臟、腹水等樣品在固體BHI培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，肉眼可見無色透明、表面光滑的微小菌落，經(jīng)PCR檢測為Hps血清4型(圖6)，與感染菌株一致。

M，DL2000 DNA Marker；1，陰性對照；2，陽性對照；3，血液；4，心臟；5，肝臟；6，肺臟；7，脾臟；8，腎臟；9，腦；10，腹水M,DL2000 DNA Marker;1,Negative control;2,Positive control;3,Blood;4,Heart;5,Liver;6,Lung;7,Spleen;8,Kidney;9,Brain;10,Ascites圖6 Hps感染小鼠各臟器的病原分離鑒定Fig.6 Isolation and identification of pathogens from various organs in Hps-infected mice

2.4 分離菌株耐藥性試驗(yàn)

將藥敏紙片貼附于平板上培養(yǎng)24 h后，測量抑菌環(huán)直徑，依據(jù)流感嗜血桿菌NCTC 8468與ATCC 49766的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)判定分離菌株的耐藥性情況，結(jié)果顯示，分離菌株LH-20201220對紅霉素、氨芐西林、頭孢美唑、阿莫西林高度敏感，對四環(huán)素、環(huán)丙沙星、復(fù)方新諾明耐藥，對氧氟沙星、氯霉素、利福平、亞胺培南為中度敏感(表3)。

表3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 討 論

Hps廣泛存在于豬的上呼吸道，它可以分解呼吸道上皮細(xì)胞的緊密連接蛋白而越過黏膜屏障，最終引起全身性感染，甚至穿透血腦屏障引起腦膜炎[19]。當(dāng)Hps其他病原混合感染時(shí)，易造成豬群大面積發(fā)病，且Hps耐藥菌株隨著規(guī)?；图s化養(yǎng)殖的發(fā)展而日趨流行，增加了豬群病情確診和防治的難度，給生豬養(yǎng)殖帶來較大的經(jīng)濟(jì)損失，引起了行業(yè)內(nèi)的廣泛關(guān)注[3,20]。目前，Hps的鑒別方法主要有染色鏡檢、衛(wèi)星生長現(xiàn)象與PCR檢測等。本試驗(yàn)使用PCR檢測方法對采集的病料進(jìn)行呼吸道疾病病原的檢測發(fā)現(xiàn)，河南省漯河豬場仔豬的呼吸道疾病疑似由Hps引起，經(jīng)革蘭染色鏡檢、衛(wèi)星生長試驗(yàn)、V因子依賴型試驗(yàn)和16S rDNA基因PCR擴(kuò)增及序列分析驗(yàn)證，確定分離菌株為Hps。Hps血清型眾多，按照傳統(tǒng)的瓊脂擴(kuò)散血清分型方法可將Hps分為15種血清型。Howell等[17]根據(jù)不同血清型Hps菌株莢膜基因座的變異特點(diǎn)設(shè)計(jì)的多重PCR分型方法，可以較為準(zhǔn)確地鑒別出Hps的不同血清型，優(yōu)于傳統(tǒng)的血清學(xué)方法。本研究利用該方法對分離菌株進(jìn)行了血清型鑒定，確定分離菌株為Hps血清4型，這與丁文文等[5]2019年得出的河南地區(qū)主要流行的Hps為血清4型的結(jié)果一致。

Hps因血清型與流行地區(qū)的差異，其致病性也存在差異，近年來不斷有Hps流行情況的調(diào)查研究，但對具體菌株的致病性研究較少。本研究利用試驗(yàn)小鼠分析分離株LH-20201220的致病性，結(jié)果表明，該分離菌株有較強(qiáng)的致病性，高劑量感染可導(dǎo)致小鼠死亡；剖檢結(jié)果顯示，感染組小鼠出現(xiàn)多器官損傷，且能從腦、肺臟、肝臟等器官中分離到感染菌株，這也證實(shí)了Hps能透過血腦屏障引起腦部感染，為后續(xù)Hps血清4型致病機(jī)制的研究提供了參考依據(jù)。

目前，對Hps的防治主要通過疫苗接種與藥物治療，但由于眾多的血清型之間缺乏有效的交叉免疫保護(hù)，尚無可以預(yù)防多種血清型感染的多價(jià)疫苗[21]。同時(shí)，由于抗生素的濫用和耐藥菌株的出現(xiàn)[22]，Hps感染時(shí)用藥不當(dāng)將造成豬群大規(guī)模發(fā)病，給養(yǎng)殖場造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，所以針對性地選擇敏感藥物進(jìn)行Hps治療就顯得尤為重要[23]。本試驗(yàn)采用紙片法篩選了分離菌株Hps的敏感藥物，發(fā)現(xiàn)其對紅霉素、氨芐西林、頭孢美唑、阿莫西林高度敏感，對環(huán)丙沙星等藥物耐藥，對氧氟沙星等中度敏感，與Zhao等[24]在2018年發(fā)現(xiàn)的Hps對洛美沙星、左氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星均呈低耐藥水平的結(jié)果有一定的出入，說明Hps的耐藥性存在時(shí)間與空間上的差異性。根據(jù)本研究藥敏試驗(yàn)結(jié)果選用敏感藥物對發(fā)病豬群進(jìn)行治療，取得了良好的治療效果。因此，在Hps發(fā)病時(shí)可根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果選取高敏藥物進(jìn)行治療，在臨床用藥遵循使用小劑量敏感藥物的原則，防止耐藥性的發(fā)生和提高治療效果。本研究結(jié)果表明，分離菌株在臨床上具有較強(qiáng)的致病性和耐藥性，提示應(yīng)加強(qiáng)動(dòng)物源Hps的流行病學(xué)調(diào)查和耐藥性監(jiān)測，為進(jìn)一步系統(tǒng)性防控該病奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)成功分離出1株Hps血清4型，與Hps參考株基因序列的相似性為97%～98%；分離菌株Hps可致感染小鼠多個(gè)器官不同程度出血，甚至死亡；分離菌株Hps對紅霉素、氨芐西林、頭孢美唑、阿莫西林敏感，對四環(huán)素、環(huán)丙沙星、復(fù)方新諾明耐藥。