姜長津，陳 云，潘鵬丞，陳寶劍，關(guān)志惠，盧慧林，謝炳坤，覃兆鮮

(1.廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南寧 530004；2.廣西壯族自治區(qū)畜牧研究所，廣西家畜遺傳改良重點實驗室，南寧 530001)

長期以來，因抗生素不規(guī)范使用導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性、動物免疫力下降產(chǎn)生對藥物的依賴性，以及畜禽產(chǎn)品中藥物殘留也會直接危害人體健康等問題日益突顯[1]，為了人與自然可持續(xù)發(fā)展，中國開始全面實施禁抗令。由于畜禽飼料中禁止添加抗生素、抗菌生長劑，因此腸道微生物多樣性與宿主生產(chǎn)性能之間的關(guān)系變得更為重要。遺傳因素是動物表型性狀最重要的決定因素，而腸道微生物作為一個額外因素，與宿主之間有著緊密的互作關(guān)系，可以腸道微生物結(jié)構(gòu)多樣性作為指示來改善生長性能[2]。腸道微生物被認(rèn)為是第二基因組，與動物的生命過程息息相關(guān)，與動物機體相互作用，在利用日糧能量的同時將飼糧中粗纖維等機體自身難以消化的能量物質(zhì)進(jìn)行發(fā)酵分解，為機體提供能量[3-4]。在豬生產(chǎn)中，即使是相同條件下飼養(yǎng)的同批次、同品種豬，在生長速度上也會存在顯著差異，這與后天生長發(fā)育過程中腸道菌群的定植有著重要聯(lián)系[5]。 16S rRNA高通量測序技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用，推動了對腸道菌群結(jié)構(gòu)與功能研究的進(jìn)程[6]。目前，腸道微生物的研究已經(jīng)成為熱點，但大多數(shù)是對生長豬初期階段腸道微生物結(jié)構(gòu)組成及功能的研究[7-8]，而對生長育肥豬中后期階段不同生長速度豬的腸道菌群研究較少。鑒于此，本研究對125日齡不同生長速度的豬進(jìn)行糞便微生物多樣性研究，以期尋找與生長速度密切相關(guān)的菌群。

1 材料與方法

1.1 動物飼養(yǎng)與樣品采集

選用由廣西壯族自治區(qū)畜牧研究所種豬場提供的杜洛克豬與陸川豬雜交得到杜陸豬，選擇同日出生、體重相近的仔豬50頭，于相同環(huán)境中飼養(yǎng)，試驗期間未轉(zhuǎn)入新豬，所有飼料和飲水均未添加抗生素，對生病豬及時淘汰出試驗組。125日齡時，對所有試驗豬稱重并采集糞便樣本，置于凍存管中，-80 ℃保存?zhèn)溆?。按體重高、低進(jìn)行排序，選擇體重最高的4頭豬作為HW組，體重最低的4頭豬作為LW組，兩組豬體重與平均日增重均差異極顯著(表1)，對兩組豬糞便樣品進(jìn)行微生物區(qū)系分析。

表1 HW和LW組豬體重與平均日增重

1.2 16S rRNA基因測序

使用TGuideS96磁珠法土壤/糞便基因組DNA提取試劑盒提取豬糞便微生物DNA，根據(jù)保守區(qū)選擇16S rRNA基因V3-V4區(qū)進(jìn)行擴增，引物序列為：338F：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′，806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′，擴增目的區(qū)間長度約為470 bp。PCR反應(yīng)體系10 μL：模板DNA 10 ng，上、下游引物(10 μmol/L)各0.3 μL，KODFX Neo Buffer 5 μL，dNTP(各2 mmol/L) 2 μL，KODFX Neo 0.2 μL，ddH2O補足體系。PCR擴增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共25個循環(huán)；72 ℃延伸7 min；4 ℃保存。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，對鑒定正確的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化、定量和均一化形成測序文庫，建好的文庫先進(jìn)行文庫質(zhì)檢，質(zhì)檢合格的文庫用Illumina Novaseq 6000進(jìn)行測序，對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控?；?7%相似度進(jìn)行聚類分析，在OTU水平上進(jìn)行稀釋曲線分析。

1.3 糞便菌群區(qū)分分析

對測序數(shù)據(jù)使用Trimmomatic v 0.33軟件進(jìn)行質(zhì)量過濾，使用Usearch v 10.0軟件雙端序列拼接，使用UCHIME v 4.2軟件去除嵌合體后得到有效序列信息，將得到的有效序列進(jìn)行聚類，獲得OTU。基于聚類分析結(jié)果進(jìn)行Alpha多樣性分析(Ace、Chao1、Simpson、Shannon、PD、Coverage指數(shù))，使用QIIME進(jìn)行主成分分析、顯著物種差異等分析。

1.4 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)經(jīng)Excel進(jìn)行初步整理后，使用SPSS 25.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，使用t檢驗進(jìn)行組間差異分析，對豐度前30的菌群進(jìn)行斯皮爾曼(Spearman)秩相關(guān)分析，并篩選出相關(guān)性>0.1且P<0.05的菌群。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 PCR擴增與數(shù)據(jù)質(zhì)控分析

由Sob和Shannon稀釋曲線可以看出，當(dāng)樣品隨機抽取數(shù)量達(dá)8 000時曲線逐漸趨于平緩，稀釋曲線最終均達(dá)到平臺期(圖1)，表明測序深度符合后續(xù)試驗要求。

2個試驗組共得到有效序列598 053個，其中HW組有296 761個有效序列，LW組有301 292個有效序列。2個試驗組共獲得943個OTUs，其中共有OTUs為828個，HW組特有OTUs為61個，LW組特有OTUs為54個(圖2)。

2.2 豬糞便菌群Alpha多樣性分析

對HW和LW組所有樣本進(jìn)行Ace、Chao1、Simpson、Shannon、PD、Coverage指數(shù)分析，之后對組間指數(shù)進(jìn)行t檢驗，結(jié)果顯示，HW和LW組間Alpha多樣性差異均不顯著(P>0.05;表2)。

2.3 豬糞便菌群主成分分析

對HW和LW組所有樣本進(jìn)行主成分分析，結(jié)果顯示，在門水平(圖3A)和屬水平(圖3B)HW和LW組菌群結(jié)構(gòu)完全分開，同一日齡不同體重的兩組豬中，糞便菌群結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯的差異。

圖1 Sob(A)和Shannon(B)稀釋曲線Fig.1 Sob (A) and Shannon (B) rarefaction curves

圖2 糞便菌群OTU水平物種Venn圖Fig.2 Venn diagram of OTU level species in HW and LW groups

表2 Alpha多樣性指數(shù)分析

圖3 糞便菌群門水平(A)和屬水平(B)主成分分析圖Fig.3 PCA chart of the fecal flora at the phylum (A) and genus (B) levels

2.4 豬糞便菌群組成及差異分析

對HW和LW組所有樣本進(jìn)行分類學(xué)分析，共檢測到門水平17個，綱水平30個，目水平58個，科水平120個，屬水平271個，種水平302個。HW和LW組共有16個(94.12%)門(圖4A)，其中厚壁菌門(Firmicutes，在HW和LW組分別占比62.07%和60.69%)、擬桿菌門(Bacteroidetes，在HW和LW組分別占比13.41%和25.38%)、螺旋體門(Spirochaetes，在HW和LW組分別占比15.45%和8.80%)為主要優(yōu)勢菌門，檢測到熱袍菌門(Thermotogae)為LW組特有菌門(圖4B)，但在LW組中占比極小。HW和LW組厚壁菌門與擬桿菌門的占比分別為4.62%和2.39%，HW組的比值高于LW組。通過t檢驗對體重高、低組進(jìn)行差異菌群分析，共發(fā)現(xiàn)3個差異菌門，分別是擬桿菌門、纖維桿菌門(Fibrobacteres)和髕骨細(xì)菌門(Patescibacteria)。LW組擬桿菌門豐度極顯著高于HW組(P<0.01)，纖維桿菌門豐度顯著高于HW組(P<0.05)，而髕骨細(xì)菌門豐度則顯著低于LW組(P<0.05)。螺旋體門(Spirochaetes)在HW組(15.45%)中的豐度高于LW組(8.8%)，但差異不顯著(P>0.05)。

A，Venn圖；B，條形圖。下同A,Venn diagram;B,Bar plots.The same as below圖4 門水平HW和LW組豬糞便菌群組成Fig.4 Compostion of the fecal flora in HW and LW groups pigs at the phylum level

在屬水平上，HW和LW組共有菌屬231個(85.24%)，HW和LW組特有菌屬分別有16和24個(圖5A)。 HW組優(yōu)勢菌屬為密螺旋體屬(Treponema_2，15.60%)、乳桿菌屬(Lactobacillus，10.97%)和鏈球菌屬(Streptococcus，5.82%)，LW組優(yōu)勢菌屬為不可培養(yǎng)菌屬_f_Muribaculaceae(19.19%)、乳桿菌屬(14.71%)和密螺旋體屬(8.91%)。使用t檢驗對屬水平進(jìn)行差異菌屬分析，得到16個差異顯著菌屬(圖5B)。其中，HW組中優(yōu)勢菌屬密螺旋體屬是LW組的1.75倍，但差異不顯著(P>0.05);而HW組中鏈球菌豐度顯著高于LW組(P<0.05);LW組中優(yōu)勢菌屬不可培養(yǎng)菌_f_Muribaculaceae豐度極顯著高于HW組(P<0.01);其他豐度較低的菌屬，如Ruminiclostridium_9和瘤胃菌科_UCG-014(Ruminococcaceae_UCG-014)在HW組中的豐度極顯著高于LW組(P<0.01)；HW組中毛螺菌科NK4A136組(Lachnospiraceae_NK4A136__group)的豐度極顯著高于LW組(P<0.01)。

圖5 屬水平HW和LW組豬糞便菌群組成Fig.5 Compostions of the fecal flora in HW and LW groups pigs at the genus level

2.5 豬腸道微生物與生長速度的關(guān)聯(lián)分析

選取豐度前30的菌群與體重、平均日增重進(jìn)行相關(guān)性分析，在門水平上共發(fā)現(xiàn)10個菌門與體重、平均日增重呈正相關(guān)，7個菌門呈負(fù)相關(guān)，其中Patescibacteria和螺旋體門與體重、平均日增重之間呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，而纖維桿菌門呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)(圖6A)；在屬水平上共發(fā)現(xiàn)18個菌屬與體重、平均日增重呈正相關(guān)，12個菌屬呈負(fù)相關(guān)，瘤胃菌科UCG-008(Ruminococcaceae_UCG-008)、瘤胃菌科UCG-014(Ruminococcaceae_UCG-014)和密螺旋體屬(Treponema_2)呈顯著正相關(guān)(P<0.05)(圖6B)。

①A，門水平；B，屬水平。②*，差異顯著(P<0.05)；**，差異極顯著(P<0.01)①A,Phylum level；B，Genus level.②*，Significant difference (P<0.05);**，Extremely significant difference (P<0.01)圖6 HW和LW組豬糞便菌群與生長速度相關(guān)性熱圖Fig.6 Heat map of correlation between the fecal flora and the growth rate in HW and LW groups pigs

3 討 論

腸道微生物在產(chǎn)生維生素、酶和其他化合物方面起著重要作用，這些化合物在食物消化和代謝中發(fā)揮著重要作用[9]。腸道菌群多樣性對宿主是有利的[10-11]。Han等[12]研究表明，高體重組Alpha多樣性(OTU觀察值及Ace、Chao1、PD、Shannon和Simpson指數(shù))高于低體重組，與本試驗高體重組Alpha多樣性指數(shù)高于低體重組的趨勢相同。何貝貝等[13]研究發(fā)現(xiàn)，與低體重豬相比，高體重豬的Shannon指數(shù)呈現(xiàn)增長的趨勢。Cui等[14]研究發(fā)現(xiàn)，仔豬平均日增重和平均日采食量降低時，腸道微生物區(qū)系的豐富度和多樣性反而增加。以上結(jié)果表明，Alpha多樣性與體重增加之間的關(guān)系較為復(fù)雜，可能受遺傳和環(huán)境的眾多因素影響而表現(xiàn)出不同的結(jié)果，但更多的研究結(jié)果偏向于菌群多樣性對宿主健康生長起到積極的作用。

在門水平上，高、低體重組平均日增重的優(yōu)勢菌群均為厚壁菌門、擬桿菌門和螺旋體門，但兩組間擬桿菌門存在顯著差異，這與陳寶劍等[15]研究結(jié)果相吻合。Ban-Tokuda等[16]研究發(fā)現(xiàn)，擬桿菌門與血漿瘦素呈顯著相關(guān)，擬桿菌門可能通過影響體內(nèi)脂肪堆積從而影響體重，且隨著體重的增加，擬桿菌門豐度下降，厚壁菌門豐度上升。Murphy等[17]研究顯示，厚壁菌門可能通過促進(jìn)淀粉等的代謝及丁酸等短鏈脂肪酸的生成為機體提供更多的營養(yǎng)物質(zhì)，而丁酸對肌肉脂肪組織和體重的增加有一定促進(jìn)作用[18]。徐娥等[19]研究表明，大約克豬腸道中的厚壁菌門可能與飼糧中淀粉多糖和蛋白質(zhì)的消化有關(guān)。本試驗中，高體重組擬桿菌門豐度顯著低于低體重組，厚壁菌門豐度高于低體重組，與前人研究結(jié)果趨勢一致。Guo等[20]研究表明，擬桿菌門與體重呈顯著負(fù)相關(guān)，與本研究中擬桿菌門與體重、平均日增重呈負(fù)相關(guān)的趨勢一致，高體重組厚壁菌門與擬桿菌門的比值高于低體重組。

在屬水平上，高體重組密螺旋體屬豐度高于低體重組，密螺旋體能夠分解飼糧中宿主難以分解的多糖，豬飼糧中難以消化的粗纖維主要在大腸中通過菌群發(fā)酵[21]，為機體提供此部分的能量，這可能是密螺旋體與體重、平均日增重呈正相關(guān)的原因，然而大多對密螺旋體的研究都顯示其為有害菌，與生長性能呈負(fù)相關(guān)[22]，因此，對密螺旋體還需進(jìn)行更深入、廣泛的研究。Tang等[23]研究發(fā)現(xiàn)，瘤胃菌屬與體重、日增重呈極顯著正相關(guān)，高體重組中瘤胃菌屬UCG-014(Ruminococcaceae_UCG-014)和瘤胃菌屬UCG-013(Ruminococcaceae_UCG-013)豐度均極顯著高于低體重組。Angelakis等[24]研究表明，乳酸桿菌對體重增加有負(fù)面影響，這與本試驗結(jié)果相同，乳桿菌與體重、平均日增重呈負(fù)相關(guān)。但也有研究得到相反的結(jié)果，即乳桿菌與平均日增重呈正相關(guān)[25]，這可能是由于乳酸菌基因組可以產(chǎn)生大量的脂肪酶和硫解酶基因，這些基因通過β-氧化來調(diào)動脂肪酸中的能量和碳。不同類型乳桿菌對碳水化合物代謝作用的不同導(dǎo)致體重產(chǎn)生差異，與體重減輕有關(guān)的乳桿菌其基因組可以編碼與果糖、甘露糖、淀粉和蔗糖代謝有關(guān)的幾種蛋白質(zhì)，而與體重增加相關(guān)的乳桿菌基因組不編碼這些蛋白質(zhì)。由于不同菌株在代謝途徑上有較大的差異[26]，這可能是對體重產(chǎn)生不同影響的原因。

4 結(jié) 論

高、低體重組豬糞便微生物群落中Alpha多樣性不顯著，125日齡杜陸豬的優(yōu)勢菌群為厚壁菌門、擬桿菌門和螺旋體門，高體重組厚壁菌門與擬桿菌門的比值高于低體重組，核心優(yōu)勢菌屬為乳桿菌屬和螺旋體屬。對豐度前30的菌群相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，有10個菌門、18個屬與體重、平均日增重呈正相關(guān)，7個菌門、12個屬與體重、平均日增重呈負(fù)相關(guān)。