陳桃香，吳海燕，黃申琴，胡成剛

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025)

馬桑來(lái)源于馬?？浦参锺R桑CoriariasinicaMaxim多年生落葉小喬木或灌木植物，又稱醉魚(yú)草、扶桑。目前對(duì)馬桑的研究相對(duì)較少，現(xiàn)有的研究中表明它具有一定的藥用價(jià)值，馬桑具有清熱解毒、活血、祛風(fēng)通絡(luò)的功效，葉用于燙傷、黃水瘡、腫毒等，研究表明馬桑的葉中含有的槲皮素Q、槲皮素-3-O-α-L-阿拉伯糖(Q-Ara)等成分具有抗炎的功效[1]。馬桑資源豐富，廣泛分布于地中海以東至日本、新西蘭、中南美洲。在我國(guó)很多省份和地區(qū)皆有馬桑的分布，例如河南、四川、貴州、云南、湖南、陜西、甘肅等[2]。目前，筆者未見(jiàn)國(guó)家及地方標(biāo)準(zhǔn)收載馬桑，調(diào)研發(fā)現(xiàn)多數(shù)民族地區(qū)以馬桑葉入藥，為適應(yīng)中藥材質(zhì)量監(jiān)督管理要求，加強(qiáng)該藥材質(zhì)量的控制，本實(shí)驗(yàn)建立了相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為其規(guī)范使用提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

UV-2700紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(島津儀器有限公司)；MODEL BX43F 光學(xué)顯微鏡(配成像系統(tǒng))；電子天平(型號(hào)：FA1004N，廠家：上海菁海儀器有限公司)；電熱鼓風(fēng)干燥箱(型號(hào)：GZX-9070MBE，廠家：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；恒溫水浴鍋(型號(hào)：HWS-24型，廠家：上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；暗箱式紫外分析儀(型號(hào)：ZF-20D，廠家：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；真空干燥箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司)；人工智能氣候箱(型號(hào)：RQX-400B，廠家：常山市華普達(dá)教學(xué)儀器公司)；硅膠G薄層板。

1.2 材料

馬桑藥材均采自貴州省，共10個(gè)批次(詳細(xì)信息見(jiàn)表1)，由貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院標(biāo)本館胡成剛教授鑒定為馬?？岂R桑屬植物馬桑CoriariasinicaMaxim的葉。槲皮素對(duì)照品(批號(hào)：C09S8Y43412，廠家：上海源葉生物科技有限公司，純度≥98%)，乙醇、甲苯、乙酸乙酯、甲酸、三氯化鋁均為分析醇。

表1 樣品信息表Tab.1 Sample information

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀鑒別

本品為橢圓形或闊橢圓形，葉對(duì)生，紙質(zhì)至薄革質(zhì)，長(zhǎng)3～10 cm，先端急尖，基部圓形，全緣，兩面無(wú)毛或沿脈上疏被毛，基出3脈，弧形伸至頂端，在葉面微凹，葉背突起；葉短柄，長(zhǎng)1～3 mm，疏被毛，紫色，基部具墊狀突起物。

2.2 顯微鑒別

葉粉末呈黃綠色。顯微鏡下觀察呈黃綠色，可見(jiàn)少量單細(xì)胞和多細(xì)胞的非腺毛，有各種導(dǎo)管及纖維束，組織細(xì)胞及葉碎片少許，表面可見(jiàn)平軸式氣孔，可以作為鑒定馬桑藥材真?zhèn)蔚蔫b定依據(jù)。見(jiàn)圖1。

圖1 馬桑藥材粉末顯微鑒定圖Fig.1 Microscopic identification of the powder ofmedicinal Coriaria sinica leaves

2.3 TLC鑒別

2.3.1 供試品、對(duì)照品溶液的制備

精密稱取馬桑藥材粉末5 g，置于250 mL的圓底燒瓶中，加60 mL60%乙醇，加熱回流提取兩次，每次1 h，過(guò)濾，合并濾液，即為供試品溶液[3]。另外精密稱取槲皮素對(duì)照品5 mg，用60%乙醇溶液制成1 mL含0.5 mg的對(duì)照品溶液。

2.3.2 方法

按照2015版《中國(guó)藥典》四部通則薄層色譜法(通則0502)[4]，分別吸取槲皮素對(duì)照品溶液和馬桑藥材的供試品溶液適量，點(diǎn)于已經(jīng)活化及飽和后的硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(5∶4∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干后，噴以3%三氯化鋁乙醇溶液，置于365 nm紫外光燈下檢視，在硅膠板上，槲皮素對(duì)照品溶液與不同產(chǎn)地的馬桑樣品在相應(yīng)位置顯示清晰顏色相同的熒光斑點(diǎn)，分離效果及重復(fù)性良好，具體見(jiàn)圖2。

圖2 十個(gè)產(chǎn)地馬桑葉藥材薄層鑒別圖Fig.2 TLC identification of medicinal Coriaria sinica leaves from 10 producing areas

2.4 檢查與浸出物的測(cè)定

按照2015版《中國(guó)藥典》中各通則項(xiàng)下的實(shí)驗(yàn)要求，通則0832水分測(cè)定法(烘干法)、2302灰分測(cè)定法(總灰分和酸不溶性灰分測(cè)定法以稀鹽酸測(cè)定酸不溶性灰分)、2201浸出物測(cè)定法(熱浸法測(cè)定醇溶性浸出物，以75%乙醇為溶劑)測(cè)定[4]，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品水分、總灰分酸不溶性灰分和浸出物含有測(cè)定結(jié)果(%，n=3)Tab.2 Determination results of the contents of moisture，total ash，acid-insoluble ash and extract(%，n=3)

2.5 槲皮素的含量測(cè)定

2.5.1 對(duì)照品溶液的制備

取槲皮素對(duì)照品適量，精密稱定，加60%乙醇溶液制成每1 mL中含3.2 μg槲皮素對(duì)照品溶液。

2.5.2 供試品溶液的制備

精密稱取馬桑粉末0.5 g，加60%乙醇超聲0.5 h，冷卻補(bǔ)重，過(guò)濾，移取0.1 mL續(xù)濾液置25 mL的容量瓶中，定容，即可得到供試品溶液[5]。

2.5.3 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇

將對(duì)照品溶液、供試品溶液分別在400～700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，發(fā)現(xiàn)供試品在274 nm處的吸收峰與對(duì)照品在257 nm處吸收峰的峰形相似，與結(jié)合所查文獻(xiàn)資料槲皮素含量測(cè)定所選擇波長(zhǎng)254 nm及256 nm相比較，選擇257 nm作為馬桑葉中槲皮素含量測(cè)定的波長(zhǎng)。

2.5.4 線性關(guān)系考察

精密稱取槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品2 mg，置于100 mL容量瓶中，加入60%乙醇溶解，定容至刻度搖勻。分別取2 mL、3 mL、5 mL、10 mL、12 mL、16 mL置于25 mL容量瓶定容至刻度。按照紫外分光光度法(《中國(guó)藥典》2015年版四部)，在257 nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度，以吸光度為縱坐標(biāo)，槲皮素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，得到線性回歸方程為Y=61.631X+0.0867(r=0.9997)，槲皮素質(zhì)量濃度在1.6～12.8 μg/mL范圍內(nèi)，吸光度與濃度呈良好的線性關(guān)系。

2.5.5 精密度實(shí)驗(yàn)

取“2.5.1”項(xiàng)下制備的槲皮素對(duì)照品溶液適量，在紫外分光光度計(jì)257 nm波長(zhǎng)下連續(xù)測(cè)定6次，RSD值為0.34%，儀器精密度良好。

2.5.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取“2.5.2”項(xiàng)下供試品溶液分別在10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min內(nèi)測(cè)定吸光度，槲皮素含量為0.25%，RSD值為0.25%，表明樣品溶液在60 min內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取馬桑粉末(過(guò)二號(hào)篩)6份，精密稱定，按照“2.5.2”項(xiàng)下的方法制備供試品，測(cè)得槲皮素含量為2.57%，RSD值為2.32%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.8 加樣回收實(shí)驗(yàn)

精密稱取已知槲皮素含量的馬桑粉末6份各0.25g，置于錐形瓶中，分別加入槲皮素對(duì)照品0.7 mg，按照上述“2.5.2”項(xiàng)下方法提取，測(cè)定其吸光度，計(jì)算槲皮素含量及回收率，槲皮素回收率在95.41%～100.33%范圍內(nèi)，平均回收率為97.63%，RSD值小于3%，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 槲皮素回收率結(jié)果(n=6)Tab.3 Quercetin recovery results(n=6)

2.5.9 樣品含量測(cè)定

精密稱取各產(chǎn)地馬桑粉末0.5 g，平行3份，按“2.5.2”項(xiàng)下的方法操作，測(cè)其吸光度，計(jì)算槲皮素含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明不同產(chǎn)地的馬桑藥材的2-甲氧基1，4-萘醌的含量差異較大，其中，含量最高的為銅仁松桃采集的樣品，含量為0.35%；含量最低的為花溪區(qū)采集的樣品，含量為0.202%，10個(gè)批次樣品平均含量為0.28%，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 不同產(chǎn)地鳳仙花的含量測(cè)定(n=3)Tab.4 Content determination of quercetin in medicinal Coriariasinica leaves from different producing areas(n=3)

3 結(jié)論與討論

本次研究分別從定性鑒別、定量測(cè)定兩部分對(duì)馬桑進(jìn)行了研究，馬桑藥材比較常見(jiàn)，外觀辨識(shí)度較高，因此主要對(duì)馬桑粉末進(jìn)行顯微鑒定，并對(duì)10批次的馬桑藥材水分、總灰分、酸不溶性灰分及浸出物進(jìn)行測(cè)定，最終擬定馬桑藥材各檢查指標(biāo)含有量為水分不超過(guò)17.0%，總灰分不超過(guò)11.0%，酸不溶性灰分不超過(guò)0.72%，醇溶性浸出物不低于33.0%。

在實(shí)驗(yàn)研究中，對(duì)薄層展開(kāi)劑、溫度、濕度等條件進(jìn)行考察，選擇以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(5∶4∶1)為展開(kāi)劑，噴以3%三氯化鋁乙醇溶液，常溫常濕條件下，置于365 nm紫外光燈下檢視。同時(shí)，考察了提取溶劑濃度、提取時(shí)間、料液比等3個(gè)單因素，在單因素考察的基礎(chǔ)上，運(yùn)用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法優(yōu)選出馬桑中槲皮素成分提取的最佳提取方法為60%乙醇，料液比為1∶12，提取時(shí)間為1 h。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道及紫外掃描顯示，最大吸收波長(zhǎng)選擇257 nm作為其檢測(cè)波長(zhǎng)。