鄒 潔，張德德，陶 毅，趙 靜，王 瓊，徐乃佳

(武漢市中醫(yī)醫(yī)院,湖北 武漢 430050)

糖尿病是由胰島素不足或者絕對缺乏導(dǎo)致的慢性疾病，臨床表現(xiàn)為血糖持續(xù)升高，該病發(fā)病多伴有多器官組織功能損傷，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[1-2]?！吨袊?型糖尿病防治指南》[3]指出，2015-2017年我國18歲及以上人群糖尿病患病率為11.2%，逐漸表現(xiàn)出年輕化的趨勢。糖尿病發(fā)生主要由免疫系統(tǒng)、神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)等多組織、多系統(tǒng)共同作用導(dǎo)致。中醫(yī)學(xué)中無糖尿病的病名，根據(jù)患者臨床表現(xiàn)可將其歸屬為“消渴”，該病最早記錄于《素問·奇病論》中:“此人必?cái)?shù)食甘美而多肥也,肥者令人內(nèi)熱,甘者令人中滿,故其氣上溢,轉(zhuǎn)為消渴”。隨著社會經(jīng)濟(jì)的進(jìn)步，人們的飲食趨于多元化，生活壓力增加，消渴的病機(jī)是本虛標(biāo)實(shí)，腎虛為本，燥熱、瘀熱、濕熱為標(biāo)。葛根素是從植物葛根中提取的異黃酮類衍生物，研究表明[4-5]，葛根素能有效促進(jìn)胰島細(xì)胞的生成，改善氧化應(yīng)激損傷，但具體機(jī)制不明確。糖尿病的病因病機(jī)極為復(fù)雜，目前尚不明確，氧化應(yīng)激損傷是主要影響糖尿病發(fā)病的因素之一。中醫(yī)學(xué)在治療消渴病有足夠的經(jīng)驗(yàn)，中藥組方或單味中藥及對糖尿病的預(yù)防和治療有顯著作用，且不良反應(yīng)小，價格低廉，是目前研究熱點(diǎn)。本研究通過對葛根素在KKAy糖尿病小鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)的干預(yù)作用及對骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2 (Bone morphogenetic protein-2，BMP-2)、血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)蛋白表達(dá)的影響，分析葛根素在糖尿病治療中的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物：SPF級雄性10周齡KKAy小鼠和C57BL/6J健康小鼠，購自武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，動物合格證號[SCXK(鄂)2020-0001]。小鼠自由飲水和進(jìn)食，平均體重(25±2)g。本實(shí)驗(yàn)研究經(jīng)我院實(shí)驗(yàn)倫理委員會批準(zhǔn)，并符合國家相關(guān)動物道德準(zhǔn)則。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥品：普通飼料購自武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，高脂飼料購自北京博泰宏達(dá)生物技術(shù)有限公司。配料組成：10%豬油、20%蔗糖、2.5%膽固醇、0.5%膽酸鈉、67%基礎(chǔ)飼料。葛根素注射液(2 ml∶100 mg，批號H20054812)；鹽酸二甲雙胍片(0.5 g/片)。丙二醛 ELISA試劑盒(批號E201902)，超氧化物歧化酶ELISA試劑盒(批號E2012011)，小鼠內(nèi)皮素1 ELISA試劑盒(批號E202006)，谷胱甘肽過氧化酶ELISA試劑盒(批號E202008)。血管內(nèi)皮生長因子抗體(批號F20012)，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2抗體(批號F16003)。PCR試劑盒(批號HGEB200015)，BCA蛋白含量檢測試劑盒(批號HGEB401210)，SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(批號HGEB75014)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器：本次研究采用的主要儀器包括血糖儀(美國強(qiáng)生公司)、低溫高速離心機(jī)(法國Jouan公司)、Benchmark Plus 酶聯(lián)免疫檢測儀(美國BIO-RAD公司)、顯微鏡(日本 Olympus 公司)、RT-PCR 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國 Promega 公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動物分組與干預(yù):將10周齡KKAy小鼠隨機(jī)分為模型組、二甲雙胍組、葛根素組，每組10只，10只C57BL/6J小鼠作為對照組。對照組小鼠采用普通飼料喂養(yǎng)，KKAy小鼠采用高脂飼料喂養(yǎng)。所有小鼠生存環(huán)境及其他飼養(yǎng)條件一致。對照組、模型組小鼠予4.3 ml/(kg·d)的0.9%氯化鈉溶液灌胃；二甲雙胍組小鼠給予二甲雙胍200 mg/(kg·d)灌胃；葛根素組小鼠給予葛根素注射液1.3 ml/(kg·d)灌胃，各組均持續(xù)干預(yù)4周。

1.2.2 糖代謝指標(biāo)含量分析：干預(yù)結(jié)束后禁食8 h，尾靜脈采血檢測四組小鼠空腹血糖(Fasting plasma glucose,FPG)、糖化血紅蛋白(Glycosylated hemoglobin,HbAlc)。放免法檢測四組小鼠空腹胰島素(Fasting insulin,FINS)。采血檢測四組小鼠餐后2 h血糖(2h postprandial blood glucose,2hBPG)。

1.2.3 胰腺組織形態(tài)學(xué)變化分析：小鼠處死后取部分胰腺組織石蠟切片脫蠟至水，切片加入蘇木素染色5 min后沖洗，再加入伊紅染色后脫水封片，顯微鏡下觀察分析各組小鼠胰腺組織細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

1.2.4 氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)分析：小鼠處死后心臟取血2 ml，置于離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速3000 r/min，離心半徑10 cm，離心10 min后取試管上清液，酶聯(lián)免疫法分析各組小鼠血清中氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)丙二醛(Malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、血漿內(nèi)皮素-1(Plasma endothelin-1，ET-1)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px)含量變化。

1.2.5 胰腺組織BMP-2和VEGF蛋白表達(dá)分析：取各組小鼠部分胰腺組織加入RIPA裂解緩沖液，收集小鼠胰腺組織中蛋白樣品，BCA蛋白濃度測定試劑盒測定各組小鼠胰腺組織中蛋白質(zhì)的濃度。蛋白質(zhì)樣品中加入適量SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳，冰浴中轉(zhuǎn)膜至PDVF膜上，洗滌液漂洗后置于4 ℃下封閉過夜，添加一抗與Actin孵育過夜，洗滌后添加二抗，洗滌3次后ECL試劑進(jìn)行顯影，分析蛋白相對表達(dá)情況。

1.2.6 RT-PCR法檢測BMP-2和VEGF mRNA表達(dá)：RNA抽提試劑盒提取不同組小鼠胰腺組織中總RNA量，應(yīng)用Primer5.0在逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA后設(shè)計(jì)引物序列，RT-PCR法檢測各組大鼠胰腺組織中BMP-2和VEGF mRNA表達(dá)量，采用 2-△△Ct方法分析數(shù)據(jù)。引物序列，見表1。

表1 擴(kuò)增引物序列

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠糖代謝指標(biāo)含量比較 見表2。模型組小鼠血清中FPG、2hBPG、HbAlc含量均高于對照組，而FINS低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。干預(yù)后，二甲雙胍組、葛根素組小鼠血清中FPG、2hBPG、HbAlc含量均低于模型組，而FINS水平高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 各組小鼠糖代謝指標(biāo)含量比較(ng/ml)

2.2 各組小鼠胰腺組織形態(tài)學(xué)比較 對照組小鼠胰腺組織細(xì)胞排列緊密，結(jié)構(gòu)完整，胰島細(xì)胞生長均勻旺盛，細(xì)胞質(zhì)豐富無空泡；模型組小鼠組織間隙增寬，細(xì)胞排列紊亂形態(tài)不完整，細(xì)胞核損傷嚴(yán)重，有明顯的空泡；經(jīng)干預(yù)治療后，二甲雙胍組、葛根素組小鼠出現(xiàn)組織形態(tài)恢復(fù)改善，損傷有所減輕，胰島細(xì)胞排列緊密，空泡減少(圖1)。

A：對照組；B：模型組；C：二甲雙胍組；D：葛根素組

2.3 各組小鼠氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)比較 見表3。模型組小鼠血清中MDA、ET-1含量均高于對照組，SOD、GSH-Px含量均低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。干預(yù)后，葛根素組小鼠MDA、ET-1含量均低于對照組，SOD、GSH-Px含量均高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表3 各組小鼠氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)比較

2.4 各組小鼠胰腺組織中BMP-2和VEGF mRNA表達(dá)量比較 見表4。模型組小鼠胰腺組織中BMP-2和VEGF mRNA表達(dá)量均高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。干預(yù)后，二甲雙胍組、葛根素組的BMP-2和VEGF mRNA含量均低于模型組，且葛根素組最低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表4 各組小鼠胰腺組織中BMP-2、VEGF mRNA表達(dá)量比較

2.5 各組小鼠胰腺組織中BMP-2和VEGF蛋白表達(dá)量比較 見表5(圖2)。模型組小鼠胰腺組織中BMP-2、VEGF蛋白表達(dá)量均高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。干預(yù)后，二甲雙胍組、葛根素組小鼠胰腺組織中BMP-2和VEGF蛋白表達(dá)量均低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表5 各組小鼠胰腺組織中BMP-2和VEGF蛋白相對表達(dá)量比較

A：對照組；B：模型組；C：二甲雙胍組；D：葛根素組

3 討 論

糖尿病是臨床常見代謝性疾病，病程長久，并發(fā)癥多，且隨著人們飲食結(jié)構(gòu)改變和生活水平的改變，糖尿病發(fā)病率在全球呈現(xiàn)出增高趨勢。糖尿病發(fā)病多與微循環(huán)障礙、代謝異常、基因多態(tài)性等因素有關(guān)[6]。葛根素是提取自中藥葛根的黃豆甙元8-C-葡萄糖甙化合物。研究顯示，葛根素能夠有效抑制免疫炎癥反應(yīng)，改善微循環(huán)，提升血清胰島素水平，降低組織過度氧化應(yīng)激導(dǎo)致的胰腺細(xì)胞損傷[7-8]。隨著社會經(jīng)濟(jì)的進(jìn)步，人們的飲食趨于多元化，生活壓力增加，糖尿病的患病率明顯增加，消渴的病機(jī)是本虛標(biāo)實(shí)，腎虛為本，燥熱、瘀熱、濕熱為標(biāo)。糖尿病病因病機(jī)極為復(fù)雜，目前尚不清晰，但在糖尿病的發(fā)病機(jī)制中，氧化應(yīng)激損傷是主要影響因素之一。中醫(yī)學(xué)治療消渴病有足夠的經(jīng)驗(yàn)，中藥組方或單味中藥對糖尿病的預(yù)防和治療有顯著作用，且不良反應(yīng)小，價格低廉[9-11]。

糖尿病發(fā)病初期，機(jī)體氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞受損與抗氧化平衡紊亂導(dǎo)致的組織間炎癥，是導(dǎo)致胰腺組織細(xì)胞功能失調(diào)的主要原因[12-13]。機(jī)體抵御組織間自由基導(dǎo)致的氧化損傷的重要屏障是抗氧化酶系統(tǒng)，在降低糖脂水平時進(jìn)行抗自由基氧化治療，能夠有效提高胰島細(xì)胞的敏感性，從而改善葡萄糖耐受水平。SOD、MDA、ET-1、GSH-Px是反映機(jī)體氧化應(yīng)激水平的主要指標(biāo)。SOD可清除組織間多余的自由基，保護(hù)細(xì)胞免受自由基損害[14]。MDA是自由基氧化反應(yīng)最終產(chǎn)物，其含量變化是脂質(zhì)過氧化的體現(xiàn)，間接反映細(xì)胞損害程度[15]。ET-1是機(jī)體內(nèi)重要的縮血管多肽，能夠舒張血管，抑制內(nèi)皮細(xì)胞增值，并且能夠促進(jìn)血管收縮，維持血管內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)[16-17]。GSH-Px是體內(nèi)不可缺少的過氧化物分解酶，是機(jī)體重要的抗過氧化能力指標(biāo)之一，GSH-Px可催化谷胱甘肽轉(zhuǎn)化為氧化型谷胱甘肽，保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)及功能不受過氧化物的損害[18]。BMP-2是TGF-β家族之一，在血液中能夠促進(jìn)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，對血管重建具有重要意義[19]。VEGF主要通過特異性的受體作用于血管中的內(nèi)皮細(xì)胞，通過調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖從而影響微血管的形成[20]。

本次探究結(jié)果顯示，模型組小鼠與對照組相比，小鼠胰腺組織損傷嚴(yán)重，組織細(xì)胞形態(tài)不完整，并伴有明顯的空泡，血清中MDA、ET-1、SOD、GSH-Px含量發(fā)生明顯變化，這表明糖尿病KKAy小鼠出現(xiàn)明顯的氧化應(yīng)激損傷，而且胰腺組織中BMP-2和VEGF mRNA及蛋白表達(dá)明顯變化，這與糖尿病的發(fā)病機(jī)制一致。與模型組相比，葛根素干預(yù)能夠明顯改善KKAy小鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)，降低血糖，改善KKAy小鼠胰腺組織細(xì)胞形態(tài)，而且能夠有效的調(diào)控小鼠胰腺組織中BMP-2和VEGF蛋白及mRNA的表達(dá)。

綜上所述，葛根素可改善糖尿病KKAy小鼠胰腺組織損傷，降低氧化應(yīng)激反應(yīng)，調(diào)控BMP-2、VEGF蛋白及基因的表達(dá)，為葛根素后續(xù)治療糖尿病提供了新思路。