管延鵬,崔靈芝,莊倩倩,劉新利

齊魯工業(yè)大學(山東省科學院)生物工程學院,山東省微生物工程重點實驗室,濟南 250353

沙門氏菌是一種重要的食源性致病菌,其致病性研究對維護公共衛(wèi)生安全具有重要意義[1]。我國約有70起食源性病原微生物中毒事故受沙門氏菌感染,每年感染200多萬人[2],造成不可估量的經(jīng)濟損失。

沙門氏菌屬于腸桿菌科,為革蘭氏陰性短桿菌。目前全世界已分離出2 543個血清型,其中中國發(fā)現(xiàn)了287個血清型[3]。沙門氏菌有兩個種,即腸道沙門氏菌和邦戈爾沙門氏菌?，F(xiàn)在已知的沙門氏菌有人類致病菌、動物致病菌,也有對人和動物都致病的細菌(人獸共患沙門氏菌)。吃沙門氏菌感染的食物會導致食物中毒。沙門氏菌在自然界中分布廣泛,是引起食物中毒的重要致病菌。它很容易在沒有中間宿主參與的情況下通過直接或間接途徑傳播給人類或動物。感染后,沙門氏菌可引起三種疾病,即腸熱、敗血癥和腸胃炎[4]。

傳統(tǒng)沙門氏菌檢測方法存在操作復雜、檢測時間長、結果誤差大等缺點[5]。因此,迫切需要建立一種快速、簡便、準確的檢測沙門氏菌中致人獸共患病基因的方法,為食品生產(chǎn)的各個環(huán)節(jié)加強食源性微生物的檢測提供方法依據(jù),確保食品質(zhì)量安全[6]。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株

腸炎沙門氏菌菌株30株。

1.2 實驗試劑

LB營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基,沙門氏菌顯色培養(yǎng),緩沖蛋白胨水(BPW),亞硒酸鹽胱氨酸(SC)增菌液,細菌基因組提取試劑盒(TIA Namp bacteria DNA Kit 離心柱型),PCR試劑,TAE緩沖液。

1.3 研究方法

1.3.1 全基因組測序及序列比對分析

使用離心柱法對30株不同來源的沙門氏菌進行基因組DNA提取,將提取的30株沙門氏菌的全基因組使用Roche 454焦磷酸測序進行全基因組DNA的測定,并將測序片段使用SOAP、Spades、Abyss軟件進行組裝,并使用CISA軟件進行整合,最終得到30株菌的全基因組DNA序列信息。

使用Ridom SeqspHere+軟件(生物信息學軟件)進行cgMLST分析,腸炎沙門氏菌菌株P125109(GenBank登錄號NC 011294)的基因組用作參照基因組[7]。然后使用腸炎沙門氏菌菌株EC20121175(GenBank登錄號CP--007269.2)的基因組與參考基因組進行比較以建立核心和輔助基因組基因的列表。鑒定試驗菌株之間的所有具有等位基因差異的基因[8]。然后通過在參考基因組中搜索特定序列并驗證每個密碼子中的等位基因變化來對每個等位基因表征多態(tài)性。最后,使用了中國醫(yī)學科學院病原生物學研究所、北京協(xié)和醫(yī)學院(北京,中國)的致病菌毒力因子數(shù)據(jù)庫,以確定預測的人獸共患病致病基因。

1.3.2 PCR引物設計

根據(jù)五個預測的人獸共患病致病性基因(invA、pduD、kduI、yigM、mgtA),在GeneBank數(shù)據(jù)庫中搜索相同物種的五個預測致病性基的DNA序列。把結果進行對比找到同源性高的保守區(qū)域的致病基因的擴增靶序列,并將其從NCBI網(wǎng)站下載下來,運用Primer Premier 5.0進行引物設計,用Primer Premier 5.0軟件根據(jù)引物設計原則,設計5對引物,根據(jù)多重PCR引物設計原則,設計的引物產(chǎn)物長度之間相差都不低于50 bp,引物序列見表2。設計相關引物并進行驗證。

1.3.3 PCR擴增條件優(yōu)化

反應采用25 μL體系,在0.2 mL離心管中進行。以沙門氏菌菌株G1為4個基因陽性菌株,參考表2引物的標準退火溫度依次對每個基因的退火溫度進行梯度設置。

1.3.4 沙門氏菌的培養(yǎng)鑒定

針對沙門氏菌擴增培養(yǎng)、分離過程,以國家衛(wèi)生學檢驗標準(GB/T 4789.4—2008)為參考。先在離心管內(nèi)吸取5 mL 滅菌的生理鹽水,然后加入沙門氏菌樣品,室溫靜置30 min；渦旋振蕩使樣品均勻混合后吸取出1 mL混合的生理鹽水轉(zhuǎn)入50 mL BPW中,36 ℃水浴10 h。再取出1 mL的BPW培養(yǎng)物,轉(zhuǎn)入盛有10 mL的SC的錐形瓶中,42 ℃培養(yǎng)18～24 h[9]。用已滅菌的接種環(huán)蘸取菌液,通過三區(qū)劃線法來把細菌接種于沙門氏菌顯色培養(yǎng)基上,于36 ℃培養(yǎng)42 h后觀察結果。

1.3.5 多重PCR擴增

PCR擴增體系(25 μL):根據(jù)多次單重PCR摸索成功的擴增體系,在各個基因單重PCR的條件范圍內(nèi),篩選出多重PCR的擴增體系,通過調(diào)節(jié)各引物的濃度比、PCR Buffer濃度、dNTP濃度建立檢測這5種致病基因的多重PCR。PCR產(chǎn)物進行凝膠電泳檢測。

2 結果與分析

2.1 人獸共患基因的預測結果

通過對雞蛋和病人中分離的30種腸炎沙門氏菌菌株進行全基因組測序然后用軟件Ridom SeqspHere +進行cgMLST基因組分析,預測invA、pduD、kduI、yigM、mgtA這5個致病基因為沙門氏菌的人獸共患病基因(表1)。

表1 基因信息

2.2 PCR引物設計結果

通過表2看出,設計的引物是為了后續(xù)做五重PCR的引物,因此設計的產(chǎn)物長度之間相差不低于50 bp,相差最小的為88 bp,退火溫度在55.9～60.0 ℃之間,BLAST比對同物種同源性較高,有很好的特異性。

表2 引物的詳細信息

續(xù)表2

2.3 沙門氏菌的培養(yǎng)鑒定結果

圖1是沙門氏菌菌株G1顯色培養(yǎng)基三區(qū)劃線法培養(yǎng)24 h后的結果,平板上出現(xiàn)肉眼可見的紫紅色菌落,扁平透明,表面光滑,直徑約2 mm,初步判定培養(yǎng)出的菌落是沙門氏菌菌落,其他菌株的鑒定結果也均是肉眼可見的品紅色菌落。

圖1 G1菌株培養(yǎng)24 h結果

2.4 PCR擴增條件優(yōu)化結果

根據(jù)各引物單重PCR所建立的擴增條件和參數(shù)范圍,最后優(yōu)化出一個適合五個引物的五重PCR方法的條件,建立的五重PCR方法為:25 μL的擴增體系在0.2 mL離心管中加入,依次加入以下組分:15 μL ddH2O(雙蒸水)；2.5 μL 10× PCR Buffer(含Mg2+)；dNTP 2 μL；invA-F/R各0.25 μL；kduI-F/R各0.4 μL；pduD-F/R各0.25 μL；yigM-F/R各0.5 μL；mgtA-F/R各0.25 μL；Taq酶0.5 μL；DNA模板2 μL。短暫離心后立即PCR。

PCR 擴增條件為:94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s,62 ℃退火30 s;72 ℃延伸1 min,30個循環(huán),最后72 ℃延伸5 min。PCR 擴增完畢,取5 μL PCR產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳25 min,然后在凝膠成像系統(tǒng)下拍照記錄結果(見圖2)。

圖2 invA、pduD、kduI、yigM、mgtA電泳圖

利用上面建立的五重PCR擴增體系對同時含有五種致病基因的沙門氏菌G1陽性菌進行PCR檢測,PCR擴增產(chǎn)物的電泳圖如圖2所示。沒有出現(xiàn)雜條帶,擴增的目的條帶大小跟引物長度大小一致,從下到上依次是mgtA131 bp、kduI301 bp、yigM389 bp、invA461 bp、pduD587 bp。說明建立的多重PCR特異性良好。

3 結 論

沙門氏菌被認為是一種新興的食源性人獸共患病病原體,有證據(jù)表明商業(yè)家禽產(chǎn)品與人類疾病之間存在明顯的流行病學聯(lián)系[8]?，F(xiàn)在沙門氏菌已經(jīng)成為公共衛(wèi)生影響廣泛的病原體,家禽業(yè)和公共衛(wèi)生服務部門都對這種病原體進行了積極的監(jiān)測。本實驗在查閱國內(nèi)外文獻的基礎上,通過實驗進一步驗證沙門氏菌的人獸共患病基因,建立了檢測沙門氏菌人獸共患病基因的五重PCR方法,與常規(guī)PCR方法的符合率達100%,本實驗建立的五重PCR方法操作不僅簡單快速省時省力,在敏感性和特異性方面與標準PCR幾乎沒有差異,可以同時對多個菌株的不同致病基因進行檢測和鑒定,該套方法能對沙門氏菌的致病性從遺傳基因的角度進行檢測,為以后的沙門氏菌人獸共患病靶基因的檢測和溯源提供依據(jù)和參考資料,可用于沙門氏菌致病基因的快速檢測和不同人獸共患病基因流行病學調(diào)查,為指導沙門氏菌人獸共患病的研究提供輔助技術,在科研方面具有實用性和研究價值[10]。