王佳琳,林 源,張 璇,宋龍飛,劉雪琪,石 林,b,秦偉帥,王岱杰,孟 武,b*

1.齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院) a.生物學(xué)院;b.生物基材料與綠色造紙國家重點實驗室,山東濟(jì)南 250353；2.泰山學(xué)院 生物與釀酒工程學(xué)院,山東泰安 271000；3.山東省分析測試中心,山東濟(jì)南 250014

格瓦斯“KbaC”最早源于我國,是一種用麥芽或面包屑,由乳酸菌和酵母菌等菌種發(fā)酵釀制而成的清涼飲料[1],它不僅色、香、味俱佳,而且營養(yǎng)成分十分豐富。經(jīng)分析測定,格瓦斯飲料中含有多種糖類、有機(jī)酸、維生素E、泛酸和煙酰胺,還含有大量的維生素B,有微量酒精和CO2,口感酸甜適口,可清熱解渴和代酒助興,兒童也可飲用,是一種營養(yǎng)豐富的飲料[2]。格瓦斯具有天然發(fā)酵的醇香味,乙醇含量低,且富含人體所需的多種氨基酸、維生素,具有促進(jìn)人體消化、改善腸胃功能[3]、消除疲勞[4]、增加睡眠[5]等多種保健功效,在我國北方一些城市曾作為一種最主要的夏季飲料[6]。

紅棗的營養(yǎng)成分既全面又豐富,含有多種具有保健作用的生物活性物質(zhì)[7-8],是我國食品中具有明顯優(yōu)勢和國際競爭力的保健食品,是集藥、食、補三大功能為一體的保健食品[9]。紅棗具有極高的營養(yǎng)價值,富含蛋白質(zhì)、生物多糖類物質(zhì)、氨基酸(尤其是人體必需的8種氨基酸)、胡蘿卜素、B族維生素、維生素C及鈣、磷、鐵等礦物質(zhì)元素,號稱天然維生素藥丸[10],是中國的特色農(nóng)產(chǎn)品和果品資源。

“黑參”由西洋參經(jīng)熱處理發(fā)生美拉德反應(yīng)和水解反應(yīng)制成,具有極高的營養(yǎng)價值,相較于西洋參,黑參人參皂苷含量增加、燥性成分減少、顏色由淺黃色變?yōu)楹诤稚?、人參皂苷轉(zhuǎn)化為稀有人參皂苷。

紅棗黑參面包格瓦斯飲料是以烤面包干、麥芽汁、紅棗汁和黑參為主要原料,經(jīng)乳酸菌、 酵母菌混合發(fā)酵,滅菌,過濾等工藝制成的飲料,兼有酵母菌和乳酸菌的雙重發(fā)酵風(fēng)味,所以口味較獨特。紅棗黑參面包格瓦斯飲料綜合了紅棗、黑參、面包、麥芽汁的營養(yǎng)特性及乳酸菌、酵母菌發(fā)酵的優(yōu)點,不但酸甜適口,而且還具有天然發(fā)酵的醇香味及較濃郁的麥芽味、烤面包味、紅棗風(fēng)味及黑參的焦甜香味,其含有稀有人參皂苷、氨基酸、有機(jī)酸、還原糖、多種維生素等營養(yǎng)成分,不僅色澤及口感俱佳,還能增強(qiáng)人體消化功能和抗腫瘤的作用,是保健的飲料佳品。

格瓦斯飲料傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝是二次發(fā)酵法,即首先將面團(tuán)發(fā)酵烤成面包,然后把面包烤干、加水泡汁、糖化,再利用酵母菌和乳酸菌等混菌發(fā)酵而成。目前,格瓦斯的研究多集中在風(fēng)味種類、發(fā)酵及生產(chǎn)工藝階段,尚未有關(guān)于其特定香氣成分的研究。本實驗是在此基礎(chǔ)上,通過改良發(fā)酵條件、發(fā)酵底物和混菌種類,得出最佳的發(fā)酵產(chǎn)品。建立了頂空-固相微萃取(HS-SPME)-氣相色譜法檢測格瓦斯香氣成分中的吡嗪類化合物的方法,尤其是近期研究熱點四甲基吡嗪(TMP)[11-12]。因此,本實驗對格瓦斯特定香氣成分的測定分析有著重要的意義。

1 材料與方法

1.1 菌種及原料

釀酒酵母、乳酸菌:齊魯工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院微生物酶技術(shù)實驗室；濃縮紅棗汁:河北沛然世紀(jì)生物食品有限公司；黑參:山東省分析測試中心；干大麥芽粉:齊魯工業(yè)大學(xué)工程訓(xùn)練中心；糖化酶:諾維信糖化酶(10 U/mL)；面包片:濟(jì)南萬達(dá)樂購超市所售大列巴；2-甲基吡嗪(2-MP)、2,6-二甲基吡嗪(2,6-DMP)、2,3,5-三甲基吡嗪(2,3,5-TMP)、四甲基吡嗪(TMP)均為色譜純,購于美國SigmaAldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電熱壓力蒸汽滅菌器滅菌鍋,MJ3780D德強(qiáng)凈化科技(山東)有限公司；恒溫水浴鍋,DK-8D上海精宏實驗設(shè)備有限公司；糖度計,H1987河北朵麥信息科技有限公司；電子天平,BSA224S賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；超凈工作臺,SW-CJ-1FD蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；培養(yǎng)箱,MJ-250鄭州生元儀器有限公司；搖床,ZQZY-CS上海知楚儀器有限公司；酒精計,H1987河北朵麥信息科技有限公司；氣相色譜儀,GC6890安捷倫公司；頂空萃取裝置,Thermolyne；三種不同涂層萃取頭,75UM CAR/PDMS,50/30 μm DVB/CAR/PDMS,85 μm PA,上海泉島科貿(mào)有限公司。

1.3 培養(yǎng)基及發(fā)酵方法

1.3.1 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基,8 °P麥芽汁培養(yǎng)基:大麥麥芽粉加4倍水,初溫度在48 ℃左右進(jìn)行糖化,水浴50 min；逐漸升溫至60 ℃,水浴3 h；升溫至70 ℃進(jìn)行水浴,用碘液試驗檢查至糖化完全為止,調(diào)整糖液濃度為8 °P,過濾后煮沸滅菌。

烤面包片制作工藝:面包→切片→烘烤 (85 ℃,100 min)→粉碎。

發(fā)酵培養(yǎng)基1(F1)H：8 °P麥芽汁培養(yǎng)基(加與大麥麥芽質(zhì)量比為0.01∶9的少量黑參)加1/80倍體積的濃縮紅棗汁,調(diào)整糖液濃度為3 °P、6 °P、9 °P,煮沸滅菌。

發(fā)酵培養(yǎng)基2(F2)：m(大麥麥芽)∶m(黑參)∶m(烤面包片)=1∶0.01∶9,加4倍水,按照50單位/g干物質(zhì)加入糖化酶,初溫度在48 ℃左右進(jìn)行糖化,水浴50 min；逐漸升溫至60 ℃,水浴3 h；逐漸升至70 ℃進(jìn)行水浴,用碘液試驗檢查至糖化完全為止,加水稀釋至糖度為8 °P,加1/80倍體積的濃縮紅棗汁后調(diào)整糖液濃度為:3 °P、6 °P、9 °P,過濾后煮沸滅菌。

發(fā)酵培養(yǎng)基3(F3):m(烤面包片)∶m(黑參)=0.01∶9,加4倍水,按照每1 g干物質(zhì)加入50單位糖化酶。48 ℃左右進(jìn)行糖化,水浴50 min；逐漸升溫至60 ℃,水浴3 h；逐漸升至70 ℃進(jìn)行水浴,用碘液試驗檢查至糖化完全為止,加水稀釋至糖度為8 °P,加1/40倍體積的濃縮紅棗汁,調(diào)整糖液濃度為:3 °P、6 °P、9 °P,過濾后煮沸滅菌。

1.3.2 發(fā)酵方法

1.3.2.1 種子培養(yǎng)方法

酵母菌種子培養(yǎng):酵母菌接入種子培養(yǎng)基,36 ℃,靜置培養(yǎng)12 h。

乳酸菌種子培養(yǎng):乳酸菌接入種子培養(yǎng)基,36 ℃,靜置培養(yǎng)36 h。

1.3.2.2 發(fā)酵方法

將兩種菌的種子液量按1∶1,總接種量按2%接入含500 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的無菌可樂瓶,瓶口用滅菌瓶蓋密封后,22 ℃,靜置發(fā)酵2～4 d。

1.4 發(fā)酵條件對格瓦斯質(zhì)量的影響實驗

試驗設(shè)接種量、初始糖度、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間等4個因素,每個因素有3個水平。以感官品評等級為標(biāo)準(zhǔn),確定3個因素的最優(yōu)組合后,檢測產(chǎn)品的酒精度,同時對3種發(fā)酵培養(yǎng)基F1、F2和F3進(jìn)行擇優(yōu)實驗,以確定生產(chǎn)格瓦斯的最佳工藝。實驗因素水平設(shè)計見表1,感官品評標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表1 發(fā)酵條件實驗因素水平設(shè)計

注：a三種發(fā)酵因素組合下所產(chǎn)格瓦斯感官品評最佳的時間。b感官品評:以飲料的色澤、香味、滋味和組織狀態(tài)為指標(biāo)。

1.5 頂空-固相微萃取(HS-SPME)-氣相色譜法的建立

1.5.1 頂空-固相微萃取條件

在20 mL裝有磁力攪拌子的頂空瓶中加入8.0 mL樣品,3 g NaCl,在60 ℃水浴、400 r/min條件下平衡10 min,插入萃取頭進(jìn)行萃取,萃取30 min取出固相微萃取儀(SPME)插入GC進(jìn)樣口解吸附5 min。

1.5.2 氣相色譜條件

色譜柱為:HP-INNOWAX毛細(xì)管柱(60 m×0.32 mm,i.d.,0.5 μm)。進(jìn)樣口溫度為250 ℃,分流比為20∶1,檢測器溫度為250 ℃,升溫程序為:50 ℃保持2 min,以5 ℃/min 升溫至150 ℃,再以15 ℃/min升溫至220 ℃。載氣為高純氮氣,流速為1 mL/min。

1.5.3 萃取頭的選擇

本研究對3種不同的萃取頭(75 μm CAR/PDMS、50/30 μm DVB/CAR/PDMS、85 μm PA)進(jìn)行萃取效率的考察,比較不同萃取頭對格瓦斯中吡嗪類物質(zhì)的萃取效果。

1.5.4 吡嗪類化合物的定性及定量分析

以4種色譜純吡嗪類化合物為標(biāo)樣,以其濃度為橫坐標(biāo),以其出峰面積為縱坐標(biāo),外標(biāo)法建立吡嗪類物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)GC-MS對所產(chǎn)格瓦斯中所含吡嗪類化合物進(jìn)行定性、定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅棗面包格瓦斯最佳工藝條件的確定

2.1.1 發(fā)酵培養(yǎng)基對產(chǎn)格瓦斯質(zhì)量的影響

考察了F1、F2、F3等3種發(fā)酵培養(yǎng)基對所產(chǎn)格瓦斯感官品評的影響,如表3所示。以F1為發(fā)酵培養(yǎng)基,以產(chǎn)格瓦斯感官品評最佳時的三種發(fā)酵因素為組合,所產(chǎn)的格瓦斯香味都呈現(xiàn)啤酒特質(zhì),面包發(fā)酵香幾乎沒有,失去了傳統(tǒng)格瓦斯的特點；同理,以F3為發(fā)酵培養(yǎng)基所產(chǎn)格瓦斯天然發(fā)酵香味淡,并呈現(xiàn)出過重的面包香味；當(dāng)以F2為發(fā)酵培養(yǎng)基,最佳單因素為組合時,所產(chǎn)格瓦斯的感官品評達(dá)到最佳。

表3 發(fā)酵條件對格瓦斯質(zhì)量的影響

2.1.2 發(fā)酵單因素試驗

以F2為發(fā)酵培養(yǎng)基,設(shè)定初始糖度為分別為3 °P、6 °P、9 °P,發(fā)酵溫度分別為18 ℃、22 ℃、26 ℃的條件下,分別按2%、3%、4%的接種量進(jìn)行發(fā)酵,以感官品評為標(biāo)準(zhǔn),確定三個因素組合所產(chǎn)格瓦斯的質(zhì)量,結(jié)果如表3。

初始糖度的影響:當(dāng)初始糖度為3 °P時,所產(chǎn)格瓦斯的色澤、香味、滋味和組織狀態(tài)都較差,接種量和發(fā)酵溫度兩個因素對所產(chǎn)格瓦斯的感官品評作用不大；當(dāng)初始糖度為6 °P時,所產(chǎn)格瓦斯的色澤都為優(yōu),其他感官品評方面受接種量和溫度的影響,接種量大于2%或溫度為18 ℃和26 ℃時,所產(chǎn)格瓦斯的香味、滋味和組織狀態(tài)均較一般；當(dāng)初始糖度為9 °P時,所產(chǎn)格瓦斯的色澤優(yōu)良,香味、滋味和組織狀態(tài)為良或差,并且所產(chǎn)酒精度較高。因此,取6 °P為最佳初始糖度。

接種量的影響:當(dāng)接種量為3%和4%時,在其他任何因素下所產(chǎn)格瓦斯的香味和滋味都為良或差；接種量為2%時,所產(chǎn)格瓦斯的感官品評各方面才能達(dá)到優(yōu)。因此,取2%為最佳接種量。

發(fā)酵溫度的影響:當(dāng)發(fā)酵溫度為18 ℃或26 ℃時,在其他任何因素下所產(chǎn)格瓦斯的香味和滋味都為良或差；溫度為22 ℃時,所產(chǎn)格瓦斯的感官品評各方面才能達(dá)到優(yōu),并且,感官品評達(dá)到最佳的時間相對較短(3 d左右)。因此,取22 ℃為最佳發(fā)酵溫度。

因此,最終確定最佳單因素工藝組合為:接種量2%,初始糖度6 °P,發(fā)酵溫度22 ℃,發(fā)酵時間3 d。

2.1.3 發(fā)酵單因素對格瓦斯酒精度的影響

以F2為發(fā)酵培養(yǎng)基,在各單因素的組合下,所產(chǎn)格瓦斯的酒精度如表4所示,酒精度主要受初始糖度的影響。當(dāng)初始糖度為3 °P時,所產(chǎn)格瓦斯中幾乎不含酒精；初始糖度為9 °P時,所產(chǎn)格瓦斯中酒精含量在2%左右；初始糖度為6 °P時,所產(chǎn)格瓦斯中酒精含量不高于1%,符合傳統(tǒng)格瓦斯酒精度1%左右的規(guī)定。

表4 發(fā)酵條件對格瓦斯酒精度的影響

2.2 格瓦斯中吡嗪類物質(zhì)定性定量分析

2.2.1 萃取頭的選擇及其萃取條件

目前,頂空固相微萃取-氣相色譜法檢測酒和飲料中的吡嗪類化合物已有相關(guān)的報道[13],但是,此技術(shù)用于格瓦斯中吡嗪類物質(zhì)檢測的研究很少。本研究主要選取3種萃取頭對吡嗪類物質(zhì)的萃取效果進(jìn)行研究,其結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同萃取頭對吡嗪類提取的影響

根據(jù)實驗結(jié)果分析,萃取頭50/30 μm DVB/CAR/PDMS對格瓦斯中吡嗪類物質(zhì)的萃取效果最好,萃取頭85 μm PA萃取效果不理想,因此,選擇50/30 μm DVB/CAR/PDMS作為吡嗪類物質(zhì)的萃取頭。由于不同的萃取條件均會影響萃取效果,我們前期已經(jīng)考察了萃取溫度、時間及離子濃度對格瓦斯中吡嗪類物質(zhì)提取的影響,確定了相對較好的萃取條件見1.5.1所示。

2.2.2 吡嗪類化合物的種類及含量的測定

本研究選取由酵母菌和乳酸菌發(fā)酵飲料中含量相對較高的4中吡嗪類物質(zhì)作為重點分析對象來建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)1.5.1中的萃取條件,進(jìn)行頂空固相微萃取。萃取結(jié)束后,按照1.5.2中的氣相色譜條件進(jìn)行檢測分析,測定格瓦斯中4種吡嗪類物質(zhì)的含量,結(jié)果見表5。

表5 格瓦斯中4種吡嗪類物質(zhì)含量的測定

3 討 論

該實驗以大麥麥芽、面包干、紅棗汁、黑參為原料,以感官品評等級為標(biāo)準(zhǔn),對發(fā)酵培養(yǎng)基中原料的配比以及接種量、初始糖度、發(fā)酵溫度及發(fā)酵時間最優(yōu)組合進(jìn)行研究。確定了最優(yōu)工藝為:發(fā)酵培養(yǎng)基為F2；接種量為2%；初始糖度為6 °P；發(fā)酵溫度為22 ℃；發(fā)酵時間為3 d。該條件下制作的紅棗面包格瓦斯成品外觀透明、色澤鮮明、有協(xié)調(diào)光澤；風(fēng)味具有本果香、發(fā)酵香、柔協(xié)、濃郁持久、無異味、爽適,具有獨特的香味；尤其具有較強(qiáng)的殺口感,搖動時有大量的氣泡,并且其酒精含量能控制在1%左右,可成為當(dāng)今新交規(guī)醉酒駕駛處罰實施后替代啤酒等酒類的一種重要飲料,有很好的經(jīng)濟(jì)前景。

建立頂空-固相微萃取(HS-SPME)-氣相色譜測定該格瓦斯中的吡嗪類物質(zhì)。由于不同涂層萃取頭具有不同大小的孔隙和對分析物有不同的親和力,并且,涂層親和力的大小遵循“相似相溶原理”。因此,固相涂層的種類和性質(zhì)在萃取過程中起決定作用,所以選擇合適涂層的萃取頭是提高分析萃取效率和靈敏度的關(guān)鍵。本研究在已確定萃取溫度、時間及離子濃度等相對較好的萃取條件和氣相色譜條件的基礎(chǔ)上,主要針對3種不同萃取頭對吡嗪類物質(zhì)的萃取效果進(jìn)行考察。實驗結(jié)果表明:1)以4種吡嗪的峰面積為指標(biāo),75 μm CAR/PDMS萃取頭表現(xiàn)出了較高的萃取效率,并且檢測出格瓦斯中TMP和2,3,5-TMP相對較高,故該萃取頭值得進(jìn)行萃取條件的進(jìn)一步優(yōu)化。2)酵母菌跟乳酸菌混菌發(fā)酵格瓦斯能夠生成吡嗪類物質(zhì),但具體機(jī)理尚不清楚。推測其原因:首先,酵母菌跟乳酸菌都能發(fā)酵生成乙偶姻[14-15],可以乙偶姻為前驅(qū)物質(zhì)經(jīng)過一系列反應(yīng)生成吡嗪類物質(zhì)[15]；其次,此混合菌能夠在此發(fā)酵條件下直接生成吡嗪類化合物。因此,酵母菌跟乳酸菌混菌發(fā)酵格瓦斯能夠產(chǎn)生吡嗪類物質(zhì)的具體機(jī)理可做進(jìn)一步研究。