蘇 蓓,杲款款,王瑞明,楊曉慧

齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)生物基材料與綠色造紙國家重點實驗室,山東 濟南 250353

細(xì)胞色素P450(cytochrome P450,CYP),是最大的基因家族之一,在所有生物中幾乎都有P450基因。隨著越來越多的P450序列被發(fā)現(xiàn),P450酶在越來越多的生理過程中的作用也逐漸得到證明。人類基因組攜帶大約57個CYP基因；在昆蟲基因組中,從最少的體虱Pediculus humanus[1]攜帶36個CYP基因到最多的蚊類mosquito攜帶170個CYP基因[2]。每個P450蛋白都是一個P450基因的表達產(chǎn)物,而P450的多樣性是連續(xù)的基因(或基因組)復(fù)制和序列差異的結(jié)果。

1982年,大鼠P450基因(CYP2B1)實現(xiàn)了第一次克隆和測序[3]；1989年,昆蟲P450基因(家蠅CYP6A1)也被克隆和測序[4]?？扇苄约?xì)菌P450的第一個晶體結(jié)構(gòu),P450cam,發(fā)表于1985年[5]；2000年,第一個哺乳動物微粒體P450的結(jié)構(gòu)被發(fā)現(xiàn)[6]。1994年家蠅CYP6A1實現(xiàn)了異源表達,這一進步為我們研究單個P450酶奠定了基礎(chǔ)。2000年果蠅基因組的測序成功,揭示了昆蟲P450序列的特點[7-8]。由于P450酶在蜜蜂中脂肪酸代謝過程中起到關(guān)鍵作用,因此近幾年細(xì)胞色素P450酶在蜜蜂上的研究也成為一大熱點。

1 細(xì)胞色素P450酶概述

1.1 結(jié)構(gòu)和功能特點

45-55kda P450蛋白的基本共同特征是它們的FeII-CO配合物在450 nm附近具有吸光度峰,它們因此被命名[9]。P450酶以其單加氧酶的作用而聞名,它能夠催化氧分子的一個氧原子向底物轉(zhuǎn)移,并將另一個氧原子還原成水。

但是,氧原子轉(zhuǎn)移并不是P450酶的唯一催化功能。它們還表現(xiàn)出氧化酶、還原酶、去飽和酶、異構(gòu)酶等活性。并且已知共同催化至少60種不同的化學(xué)反應(yīng)[10]。

大多數(shù)動物細(xì)胞色素P450依賴氧化還原伴侶提供還原當(dāng)量。一些細(xì)菌和真菌P450酶是具有多種氧化還原伴侶的融合蛋白,而一些P450酶直接作用于它們的底物,不需要雙氧或還原等價物[11]。

1.2 催化機制

氧化后的P450是兩種形式的混合物:以水為第六配位體的低自旋(FeⅢ)在硫代Cys配體的對面形成和一個高自旋(FeⅡ)的五配位形式?；捉Y(jié)合將水從第六個連接位置置換,導(dǎo)致向高自旋方向轉(zhuǎn)移。這種轉(zhuǎn)移是可以觀察到的(I型光譜),并且伴隨著P450氧化還原電位的降低,P450-底物復(fù)合物從氧化還原伴侶(P450還原酶或腎上腺素)接收第一個電子,然后亞鐵P450(FeⅡ)結(jié)合O2。在這一步驟中,CO可以和O2競爭與P450的結(jié)合。其結(jié)合形成穩(wěn)定的絡(luò)合物,該絡(luò)合物在催化上不活躍。在450 nm的光照下,CO可以被置換。然后,P450-O2-底物復(fù)合物接受第二個電子(來自P450還原酶或在某些情況下來自細(xì)胞色素b5,或來自腎上腺素)以形成過氧化鐵陰離子。在經(jīng)過質(zhì)子化后,鐵氫過氧化物絡(luò)合物引發(fā)活性氧形式的酶發(fā)揮作用。近年來,對一種關(guān)鍵中間體化合物I(通過類比過氧化物酶化合物I)進行了表征。這種中間產(chǎn)物是一種具有非定域氧化當(dāng)量的鐵(Ⅳ)氧雜化合物[12]。因此,未活化的C—H鍵的羥基化反應(yīng)遵循“反彈”機制,其中氫被化合物Ⅰ從底物中抽離,形成氫氧化鐵,然后迅速與底物自由基結(jié)合。

2 蜜蜂細(xì)胞色素P450基因的種類多樣性

目前,蜜蜂基因組已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)包含46個P450基因,表1列出了部分已經(jīng)克隆的蜜蜂P450基因。

表1 部分已克隆的蜜蜂P450基因

蜜蜂基因組中的P450基因可以分出四個不同的進化支系:線粒體P450s,以及以這些分支中重要的脊椎動物成員命名的CYP2、CYP3和CYP4分支。在昆蟲的CYP3分支中,人類的CYP3A4是最著名的成員,包括龐大的CYP6和CYP9支系[13]。在雙翅目昆蟲群中,CYP3和CYP4分支都很豐富,各占其P450總體的40%左右。CYP2進化支系在昆蟲中由多種單一成員組成,在蜜蜂中僅有8個基因,在果蠅和蚊類中分別有 6個和10個。線粒體P450的數(shù)量因CYP12序列的完全缺失而顯著減少。蜜蜂P450基因僅有46個,蜜蜂P450基因數(shù)量較少的主要原因是CYP4的數(shù)量嚴(yán)重不足(僅4個序列)[14]。

蜜蜂中的四種CYP4s雖然在序列特征上與其他昆蟲相似,但這四種CYP4s具有什么特定功能還未被發(fā)現(xiàn)。CYP4G11是第一個已知的來自蜜蜂的P450序列[15],在果蠅Drosophila和岡比亞按蚊An.gambiae中也發(fā)現(xiàn)了許多功能同源物,如果蠅中的CYP4G1[7]和CYP4G15、按蚊中的CYP4G16和CYP4G17。CYP4G11基因在工蜂中的表達高于蜂王。昆蟲的CYP4G成員有著非傳統(tǒng)的N末端序列,這表明蛋白質(zhì)具有不尋常的亞細(xì)胞分布,這可能與它們的功能有關(guān)。CYP4AV1和CYP4AZ1[15]基因與火蟻Solenopsisinvicta脂質(zhì)代謝相關(guān)的CYP4AB1和CYP4AB2類似[16]。

3 蜜蜂細(xì)胞色素P450基因的功能多樣性

3.1 參與蛻皮激素的合成

一些細(xì)胞色素P450基因涉及蛻皮激素或蛻皮類固醇的生物合成、活化和分解代謝。這些基因是昆蟲中最保守的P450基因之一,他們屬于CYP2族(CYP307、CYP306、CYP18)和線粒體CYP家族(CYP302、CYP314、CYP315)。微粒體C-25羥化酶被鑒定為CYP306A1,在家蠶和果蠅中屬于CYP2族的P450酶。在家蠶中,胸腺轉(zhuǎn)錄組的微陣列分析和差異顯示CYP306A1主要在胸腺中表達,并且在蛻皮類固醇產(chǎn)生時高表達。

蛻皮激素是參與昆蟲膽固醇骨架合成的重要激素,因此關(guān)于P450在蛻皮激素合成中的作用有很多相關(guān)研究。有研究發(fā)現(xiàn)CYP307、CYP306A1、CYP302A1、CYP315A1和CYP314A1是參與合成果蠅蛻皮激素的主要P450酶；另外有研究還發(fā)現(xiàn)P450也參與蛻皮激素的降解代謝,主要負(fù)責(zé)催化第26位碳的羥基化步驟[17]。

由于參與合成內(nèi)源性物質(zhì)的功能酶基因序列一般傾向于保守,利用生物學(xué)分析,通過對比果蠅與蜜蜂在序列上的相似性,認(rèn)為西方蜜蜂的CYP307B1、CYP306A1、CYP302A1、CYP315A1和CYP314A1參與蜜蜂蛻皮激素的合成[17-18]。

3.2 參與保幼激素的合成與代謝

保幼激素(juvenile hormone,JH)代謝的研究長期以來一直由酯酶和環(huán)氧化物水解酶為主,但對家蠅抗殺蟲劑菌株的早期研究表明其在氧化代謝中也發(fā)揮作用。有研究表明家蠅CYP6A1能夠有效代謝倍半萜類化合物,證實了這些早期研究。因此,JHs的羥基化和環(huán)氧化證實了P450介導(dǎo)的這些激素的代謝途徑。

在蜜蜂中,蜂王上顎腺合成蜂王信息素,而工蜂上顎腺則合成蜂王漿中最主要的成分即不飽和脂肪酸10-羥基-2-癸烯酸(10-HDA)。10-HDA不僅是蜜蜂食物中最重要的抑菌成分,同時它還是影響雌性蜜蜂級型分化的重要活性物質(zhì)之一。保幼激素(juvenile hormone,JH)是昆蟲體內(nèi)最重要的激素之一,對蜜蜂幼蟲的生長發(fā)育,級型分化,成蜂的社會分工與行為發(fā)育,腺體發(fā)育都有廣泛的影響[19]。由于意蜂工蜂血淋巴內(nèi)的JHIII含量與上顎腺分泌的10-HDA含量有顯著的正相關(guān)關(guān)系,實驗證實在合成10-HDA過程中,硬脂酸首先發(fā)生ω位或ω-1位羥基化,并且這一反應(yīng)是由細(xì)胞色素P450氧化酶催化的單加氧反應(yīng)。因此推測蜜蜂P450與保幼激素的合成與代謝相關(guān)聯(lián)[20]。

3.3 殺蟲劑的誘導(dǎo)表達及代謝

P450基因表達水平的變化可能足以改變體內(nèi)酶激活和失活之間的平衡[21]。例如,家蠅Akita-f品系的抗性與腹部微粒體中氧化酯裂解增加有關(guān)。螺旋病毒NC-86菌株的總P450水平保持不變,與一組具有高脫硫活性的P450酶被一組代謝較少對硫磷的P450酶取代有關(guān),并具有較低的脫硫/氧化酯裂解比[22]。

Toshiyuki Fujita等人利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法鑒定了CYP6AS3、CYP6AS4、CYP6AS5、CYP6AS7、CYP6AS8、CYP6AS11、CYP6BD1、CYP9Q1、CYP9Q2、CYP9Q3、CYP9S1、CYP336A1、CYP305D1、CYP315A1這14個P450酶,其中CYP6SA3和CYP6AS4被鑒定為“postcerebral glands(PcGs)選擇性”蛋白。這兩種CYP450基因都有代謝槲皮素的功能[23-24],槲皮素是蜂蜜中的一種植物化學(xué)成分。另外CYP6AS5、CYP6AS8、CYP6AS11、CYP9Q1、CYP9Q2、CYP9Q3、CYP305D1、CYP315A1八個基因為“上顎腺選擇性”蛋白,其中CYP9Q1、CYP9Q2、CYP9Q3參與蜂箱殺螨劑和槲皮素的解毒代謝[23],CYP315Al是一種被廣泛研究的蛻皮甾體生物合成酶,CYP6AS8、CYP6AS11、CYP305D1的功能尚不清楚[25]。

為了探究P450在中華蜜蜂(Apisceranacerana)解毒中的分子機制,有研究分離并鑒定了4個新的P450基因(Acc301A1、Acc303A1、Acc306A1和Acc315A1)。研究發(fā)現(xiàn)將Acc301A1、Acc303A1和Acc306A1基因利用RNA干擾技術(shù)敲除后,能夠顯著提高殺蟲劑處理后中華蜜蜂的死亡率。這個結(jié)果為研究四種P450基因在解毒中的作用提供了重要證據(jù)[26]。

3.4 上顎腺分泌物的合成

P450催化的脂肪酸ω位和ω-1位羥基化已經(jīng)在昆蟲中被報道[22]。重組CYP4C7、CYP6A1和CYP12A1大腸菌株缺乏月桂酸羥化酶活性,但果蠅CYP6A8被證明可以催化月桂酸ω-1位羥基化,這表明脂肪酸羥化酶活性不限于CYP4家族的P450。

因蜜蜂具有種姓特異性信息素表達的特點,Malka等[27]研究發(fā)現(xiàn)意大利蜜蜂基因組中的CYP4AA1和CYP18A1可能分別參與代謝脂肪酸ω位和ω-1位羥基化；他們通過生物信息學(xué)分析了兩種候選基因CYP4AA1和CYP18A1,研究了它們在蜂王以及工蜂上顎腺中的表達,實時熒光定量PCR結(jié)果顯示CYP4AA1在有無蜂王的工蜂群中均高水平表達,而在蜂王中的表達可以忽略不計。CYP18A1基因則在蜂王上顎腺中表達水平很高,在無蜂王工蜂群的上顎腺中可以忽略不計。但有蜂王的工蜂群CYP18A1的表達明顯高于無蜂王工蜂群。為CYP4AA1和CYP18A1蛋白構(gòu)建三維結(jié)構(gòu)模型,發(fā)現(xiàn)這兩個P450基因之間的活性位點存在差異,這與其具有不同的催化特異性一致。這一結(jié)果表明,CYP4A和CYP2E1這兩個P450亞家族可能分別參與代謝脂肪酸ω位和ω-1位的羥基化[17]。

10-HDA是蜜蜂上顎腺分泌的一種重要的信息素,Erika Plettner等人推測在蜜蜂體內(nèi)P450s能夠氧化合成 10-HDA中10號碳位的羥基。吳雨祺等人研究鑒定了46個與蜜蜂上顎腺中10-HDA生物合成相關(guān)的候選基因,其中包括細(xì)胞色素P450 家族成員及脂肪酸代謝β氧化和ω氧化過程中的相關(guān)P450基因[28]。并使用qPCR技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)CYP6AS8基因是蜜蜂上顎腺合成10-HDA的一個關(guān)鍵酶[29]。武雪龍等實驗前期利用比較蛋白質(zhì)組學(xué)的方法對10-HDA 分泌量差異顯著的蜜蜂上顎腺差異蛋白進行了分離和鑒定,并結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù)篩選出在10-HDA 高產(chǎn)時高表達的蛋白CYP49A1及CYP9e2,實驗最終發(fā)現(xiàn)蛋白CYP49A1可將十二烷末端氧化為羥基,產(chǎn)生十二碳一元醇；CYP9e2可催化底物癸酸發(fā)生氧化反應(yīng),得到最終產(chǎn)物為2-羥基癸二酸[30]。

4 總結(jié)與展望

細(xì)胞色素P450作為最大的基因家族中的一員,具有豐富的生物多樣性。本文主要介紹了蜜蜂中細(xì)胞色素P450基因在種類上的多樣性,以及其在蛻皮激素合成、保幼激素合成與代謝、殺蟲劑的誘導(dǎo)表達與代謝和蜜蜂上顎腺分泌物的合成等功能上的多樣性。目前針對蜜蜂P450的研究相對于其他昆蟲還比較少,但隨著分子生物學(xué)的發(fā)展以及組學(xué)研究在基因篩選及表達上的廣泛應(yīng)用,許多蜜蜂細(xì)胞色素P450基因的功能也被慢慢發(fā)現(xiàn)。

10-HDA在自然界中主要來自蜜蜂工蜂上顎腺分泌,在蜜蜂體內(nèi)合成10-HDA途徑中,P450s基因在脂肪酸羥基化過程中起到關(guān)鍵作用,涉及蜜蜂上顎腺10-HDA的生物合成,所以越來越多的研究集中到合成10-HDA過程中關(guān)鍵P450基因的篩選與鑒定。因此明確該過程中關(guān)鍵的P450基因,對了解蜜蜂細(xì)胞色素P450基因的功能和探究蜜蜂10-HDA合成途徑具有重要意義,也對探究在體外合成10-HDA路徑具有實踐意義。