彭雯杰　詹伊婧　雷鵬　孫濤　錢家熠　徐虹

摘要： 對從健康草莓根際中分離出的一株阿斯青霉菌XK-12（Penicilium asturianum），進行了產(chǎn)鐵載體的定性和定量分析，鑒定其所產(chǎn)鐵載體為異肟羥酸型鐵載體。并對XK-12產(chǎn)鐵載體發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，利用其發(fā)酵液測定了鐵載體對病原菌的抑制效果。結(jié)果表明，阿斯青霉菌XK-12產(chǎn)鐵載體的最佳發(fā)酵條件為：3.0% NH4Cl為氮源，2.0%葡萄糖為碳源，添加0.10% L-鳥氨酸鹽酸鹽，培養(yǎng)基中不含F(xiàn)e3+，初始pH 6.0，溫度28 ℃，250 ml培養(yǎng)瓶裝液量為70 ml，發(fā)酵周期為168 h;在此條件下，XK-12產(chǎn)鐵載體最高能達到0.173 mg/ml。在添加20% （體積分數(shù)）XK-12鐵載體發(fā)酵液條件下，XK-12鐵載體發(fā)酵液對草莓根腐病病原菌葡萄座腔菌（Neofusicoccum kwambonambiense XKD-1）的抑制率達到了100%。

關(guān)鍵詞： 阿斯青霉;鐵載體;發(fā)酵優(yōu)化;拮抗作用

中圖分類號： S482.2+92 文獻標識碼： A 文章編號： 1000-4440（2022）01-0073-08

Abstract： The qualitative and quantitative analyses of siderophores production were carried out on Penicilium asturianum XK-12 isolated from healthy strawberry rhizosphere. The siderophores produced by XK-12 were identified as hydroxamic acid-type siderophores， and the conditions for producing siderophores were optimized. Finally， the fermentation broth of XK-12 was used to determine the inhibitory effect of siderophores on a pathogen. The results showed that the best fermentation conditions for siderophores production by XK-12 were as follows： 3.0% NH4Cl was used as nitrogen source， 2.0% glucose was used as carbon source， 0.10% of L-ornithine hydrochloride was added， there was no Fe3+ in the medium， the initial pH was 6.0， the temperature was 28 ℃， the liquid volume in 250 ml flask was 70 ml， and the fermentation period was 168 h. Under these conditions， 0.173 mg/ml siderophores could be obtained. Under the condition of adding 20% （volume fraction） XK-12 fermentation broth， the inhibition rate of fermentation broth on strawberry root rot pathogen Neofusicoccum kwambonambiense was 100%.

Key words： Penicilium asturianum;siderophore;fermentation optimization;antagonism

鐵（Fe）是一種重要的植物營養(yǎng)元素，大多數(shù)細胞的代謝過程中都有它的參與，在植物生長過程中發(fā)揮著重要作用，主要參與了植物的呼吸作用、光合作用、氮固定以及DNA合成等[1]。鐵在地殼中的含量豐富，在所有元素中處于第4位，在多數(shù)土壤中鐵的含量非常豐富，但大部分鐵都以水解后形成的Fe（OH）3形式存在，而植物無法直接吸收和利用這些鐵[2-3]。大部分的細菌和真菌都可以分泌鐵載體，微生物鐵載體對Fe3+具有極高親和力，能協(xié)助植物從土壤環(huán)境中獲取并利用鐵，為植物的生長提供有力保障 [4]。鐵載體結(jié)構(gòu)多樣，按特征基團來分可以大致分為4種類型[5]。細菌鐵載體的結(jié)構(gòu)多樣，但真菌鐵載體大多為異羥肟酸型，它們大多擁有相似的生物合成途徑，且真菌異羥肟酸型鐵載體是以Nδ-?；?Nδ-羥基-鳥氨酸為基本單位組成的[6]。這些真菌和細菌能夠通過分泌鐵載體來螯合土壤中的鐵元素，形成Fe-鐵載體螯合物來供給自身生長，還可以與植物病原菌競爭生存必要的鐵元素來抑制病原菌的生長[7-9]。目前國內(nèi)外對鐵載體的應(yīng)用研究主要集中在農(nóng)業(yè)、漁業(yè)、重金屬修復(fù)、核燃料后處理、紙漿漂白、生物傳感等方面[10-13]。

本試驗以前期從健康草莓根際中篩選得到的一株產(chǎn)鐵載體的植物生防真菌阿斯青霉菌XK-12為試驗菌株，對所產(chǎn)鐵載體類型進行鑒定，對其產(chǎn)鐵載體的培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，最后用優(yōu)化后的除菌發(fā)酵液考察對病原菌的拮抗效果，為植物病害防治產(chǎn)品的研發(fā)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 分離自草莓健康植株根際的阿斯青霉菌（Penicilium asturianum）XK-12以及草莓根腐病病原菌葡萄座腔菌（Neofusicoccum kwambonambiense XKD-1）均保存于南京工業(yè)大學(xué)材料化工國家重點實驗室。

1.1.2 培養(yǎng)基的配制 發(fā)酵培養(yǎng)基：NH4Cl 0.250 0 g，蔗糖25.000 0 g，檸檬酸 1.000 0 g，Na2HPO4·H2O 0.125 0 g，KH2PO4 0.075 0 g，MgSO4 0.080 0 g，CaCl2 0.002 0 g，NaH2PO4·H2O 0.590 5 g，pH 6.8，1 000 ml水，115 ℃滅菌20 min。配制鉻天青（CAS）檢測液[14]。將配好的CAS檢測液轉(zhuǎn)入試劑瓶并用錫紙包裹，121 ℃滅菌15 min，避光保存。配制產(chǎn)鐵載體瓊脂培養(yǎng)基，滅菌后待培養(yǎng)基溫度降至60 ℃以下，吸取已滅菌的CAS檢測液以5%的比例緩慢加入到產(chǎn)鐵載體培養(yǎng)基中，輕輕晃勻，避免產(chǎn)生氣泡，再倒平板，待冷卻凝固后使用。

1.1.3 主要試劑 L-鳥氨酸鹽酸鹽，Acros公司產(chǎn)品;L-天冬氨酸，上海源葉生物公司產(chǎn)品;L-谷氨酸，上海源葉生物公司產(chǎn)品;氯化鐵，上海麥克林生化科技有限公司產(chǎn)品;高氯酸，上海阿拉丁生化科技股份有限公司產(chǎn)品;甲磺酸去鐵胺，上海源葉生物公司產(chǎn)品;鉻天青S，Sigma公司產(chǎn)品。

1.1.4 主要儀器 紫外可見分光光度計，上海棱光技術(shù)有限公司產(chǎn)品;立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn)品;精密pH計，上海雷磁儀器廠產(chǎn)品;隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海善治儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品;標準型凈化工作臺，蘇州凈化設(shè)備廠產(chǎn)品;回轉(zhuǎn)恒溫搖床，上海第一自動化設(shè)備公司產(chǎn)品。

1.2 菌株產(chǎn)鐵載體的定性分析

CAS法[15]確定XK-12是否能產(chǎn)鐵載體。

1.3 菌株產(chǎn)鐵載體的定量分析

通過Arnow’s法[16]、高氯酸鐵分光光度法[17]、分光光度法[18]對鐵載體的類型進行初步判斷并定量分析。

1.3.1 甲磺酸去鐵胺標準曲線制作 配制5 mmol/L FeCl3-0.1 mol/L HClO4（pH 2）溶液：稱取0.811 g FeCl3于1 L去離子水中溶解，加入8.58 ml HClO4，調(diào)pH為2，避光保存。取0.5 ml阿斯青霉菌XK-12除菌發(fā)酵液（過0.22 μm膜）與2.5 ml 5 mmol/L FeCl3-0.1 mol/L HClO4（pH 2）溶液混合，靜置顯色30 min，以發(fā)酵培養(yǎng)基為空白對照，進行全波長掃描，確定最大吸收波長（ODmax）。稱取1.0 mg 甲磺酸去鐵胺（Deferoxamine）標準品，溶于1.0 ml去離子水中，將其稀釋成7個質(zhì)量濃度梯度（0 mg/ml，0.05 mg/ml，0.10 mg/ml，0.25 mg/ml，0.50 mg/ml，0.75 mg/ml，1.00 mg/ml）。取各質(zhì)量濃度甲磺酸去鐵胺標準品0.5 ml，加入2.5 ml 5 mmol/L FeCl3-0.1 mol/L HClO4（pH 2）溶液，測定其ODmax下的OD值，以標準品的質(zhì)量濃度為橫坐標，以O(shè)D值為縱坐標，繪制鐵載體標準曲線。

1.3.2 鐵載體含量測定 取0.5 ml阿斯青霉菌XK-12除菌發(fā)酵液與2.5 ml 5 mmol/L FeCl3-0.1 mol/L HClO4（pH 2）溶液混合，測定其ODmax下的OD值，根據(jù)方法1.3.1中的標準曲線計算阿斯青霉XK-12鐵載體產(chǎn)量。

1.4 孢子懸液的制備

將PDA液體培養(yǎng)的阿斯青霉菌XK-12涂布到PDA平板，并在28 ℃下培養(yǎng)5 d，待阿斯青霉菌菌絲鋪滿整個平板并生出大量綠色孢子，吸取適量無菌水加入平板，用接種環(huán)刮下孢子，使其充分混勻。將平板上的孢子液轉(zhuǎn)移至50 ml離心管中，稀釋至1×107CFU/ml。

1.5 培養(yǎng)基成分對鐵載體產(chǎn)量的影響

在產(chǎn)鐵載體培養(yǎng)基中，接種2%的孢子懸液，將氯化銨、磷酸二氫銨、硫酸銨、乙酸銨、草酸銨分別作為氮源，以D-果糖、葡萄糖、D-麥芽糖、蔗糖、乳糖分別作為碳源，在培養(yǎng)溫度30 ℃、轉(zhuǎn)速為200 r/min的條件下培養(yǎng)5 d后，用方法1.3.2計算鐵載體產(chǎn)量，分析比較采用不同碳、氮源對阿斯青霉菌XK-12產(chǎn)鐵載體的影響，并在確定最佳碳、氮源后設(shè)置9組質(zhì)量分數(shù)梯度（1%～9%），在培養(yǎng)溫度30 ℃、轉(zhuǎn)速為200 r/min的條件下培養(yǎng)5 d后確定最佳碳、氮源質(zhì)量分數(shù)。向產(chǎn)鐵載體發(fā)酵培養(yǎng)基中加入Fe3+，使培養(yǎng)基中Fe3+終濃度分別為0 μmol/L、0.1 μmol/L、0.5 μmol/L、1.0 μmol/L、1.5 μmol/L、2.0 μmol/L，培養(yǎng)5 d后，測定鐵載體產(chǎn)量，確定培養(yǎng)基中Fe3+濃度對XK-12鐵載體產(chǎn)量的影響。將產(chǎn)鐵載體發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后，加入經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后的不同氨基酸， T1組培養(yǎng)基中不添加氨基酸（對照），T2組培養(yǎng)基中加入0.10% L-鳥氨酸鹽酸鹽，T3組培養(yǎng)基中加入0.10% L-天冬氨酸，T4組培養(yǎng)基中加入0.10% L-谷氨酸，T5組培養(yǎng)基中加入0.05% L-鳥氨酸鹽酸鹽與0.05% L-谷氨酸，T6組培養(yǎng)基中加入0.05% L-天冬氨酸與0.05% L-谷氨酸混合物，在培養(yǎng)溫度30 ℃、轉(zhuǎn)速為200 r/min的條件下培養(yǎng)5 d后，確定不同氨基酸對鐵載體產(chǎn)量的影響。

1.6 培養(yǎng)條件對鐵載體產(chǎn)量的影響

使用方法1.5中確定碳、氮源后的培養(yǎng)基，在20 ℃、25 ℃、28 ℃、30 ℃、35 ℃溫度下培養(yǎng)，在轉(zhuǎn)速為200 r/min的條件下培養(yǎng)5 d后，通過方法1.3.2測定鐵載體產(chǎn)量，并確定最佳培養(yǎng)溫度。使用碳、氮源優(yōu)化后的培養(yǎng)基，分別調(diào)節(jié)初始pH為5、6、7、8、9，在培養(yǎng)溫度30 ℃、轉(zhuǎn)速為200 r/min的條件下培養(yǎng)5 d后，通過方法1.3.2測定鐵載體產(chǎn)量來確定培養(yǎng)基最佳初始pH。使用碳、氮源優(yōu)化后的培養(yǎng)基，分別以不同裝液量（30 ml、50 ml、70 ml、90 ml、110 ml）在250 ml的三角瓶中培養(yǎng)，在培養(yǎng)溫度30 ℃、轉(zhuǎn)速為200 r/min的條件下以方法1.3.2測定鐵載體產(chǎn)量。

1.7 不同條件下鐵載體產(chǎn)量的時間曲線測定

使用優(yōu)化后的培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件，設(shè)置3組試驗，第1組加入為0.10%的鳥氨酸鹽酸鹽，第2組加入Fe3+使其終濃度為2.0 μmol/L，第3組兩者都不加（對照）。使用方法1.3.2，每24 h測定一次各組鐵載體產(chǎn)量，并繪制其在不同條件下鐵載體產(chǎn)量的時間曲線，確定阿斯青霉菌XK-12產(chǎn)鐵載體的最佳時間。

1.8 阿斯青霉菌XK-12鐵載體發(fā)酵液對病原菌生長的影響

將以上試驗中得出的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件綜合起來進行阿斯青霉菌發(fā)酵，發(fā)酵液經(jīng)0.22 μm濾膜除菌，將發(fā)酵液分別按終濃度0、5%、10%、15%、20%（體積分數(shù)）的比例添加到滅菌后的PDA培養(yǎng)基中混勻并倒平板。培養(yǎng)基凝固后，用直徑8 mm的打孔器將病原菌平板打孔并倒置接種到含鐵載體的PDA平板中央，置于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 d后，采用十字交叉法測量病原菌菌落直徑，并計算各平板病原菌的抑制率[7]。

1.9 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)利用SPSS Statistics軟件進行方差分析（P<0.05），計算所有均值的標準差。

2 結(jié)果與分析

2.1 阿斯青霉菌XK-12產(chǎn)鐵載體種類

取阿斯青霉菌XK-12發(fā)酵液，過膜除菌后吸取50 μl加入到打孔器打孔的CAS檢測平板上，置于暗處反應(yīng)30 min后平板出現(xiàn)橙紅色反應(yīng)圈（圖1），說明XK-12菌株能產(chǎn)鐵載體。

在高氯酸鐵試驗中，由XK-12制備的鐵載體溶液顏色能夠立即發(fā)生變化呈紅色，并在495 nm處出現(xiàn)吸收峰，說明該菌能夠產(chǎn)生異羥肟酸型鐵載體，因此阿斯青霉XK-12所產(chǎn)的鐵載體為異羥肟酸型鐵載體。

2.2 阿斯青霉菌XK-12鐵載體標準曲線

通過全波長掃描，確定XK-12菌株所產(chǎn)鐵載體的最大光吸收值在495 nm處，因此，我們在最大吸光值處制作相應(yīng)的標準曲線（圖2），依照此標準曲線可以計算出菌株產(chǎn)鐵載體的量。

2.3 培養(yǎng)基成分對阿斯青霉菌XK-12產(chǎn)鐵載體的影響

2.3.1 不同氮源及其質(zhì)量分數(shù)對鐵載體產(chǎn)量的影響 由圖3可知，XK-12鐵載體產(chǎn)量在不同氮源下有顯著差異，磷酸二氫銨和草酸銨作為氮源時，鐵載體產(chǎn)量最低，而氯化銨作為氮源時，鐵載體產(chǎn)量最高。進一步對氯化銨質(zhì)量分數(shù)對鐵載體產(chǎn)量的影響進行研究發(fā)現(xiàn)，隨著氯化銨質(zhì)量分數(shù)的增加，鐵載體產(chǎn)量先上升后下降，當(dāng)氯化銨的質(zhì)量分數(shù)為3.0%時，阿斯青霉菌XK-12的鐵載體產(chǎn)量最高，為0.145 mg/ml。

2.3.2 不同碳源及其質(zhì)量分數(shù)對鐵載體產(chǎn)量的影響 由圖4可知，XK-12鐵載體產(chǎn)量在不同碳源下有顯著差異，D-麥芽糖作為碳源時鐵載體產(chǎn)量最低，葡萄糖作為碳源時鐵載體產(chǎn)量最高。通過研究葡萄糖質(zhì)量分數(shù)對鐵載體產(chǎn)量的影響發(fā)現(xiàn)，隨著葡萄糖質(zhì)量分數(shù)的增加，鐵載體產(chǎn)量先上升后下降，當(dāng)葡萄糖的質(zhì)量分數(shù)為2.0%時，阿斯青霉菌XK-12的鐵載體產(chǎn)量最高，達到0.134 mg/ml。

2.3.3 不同氨基酸對鐵載體產(chǎn)量的影響 由圖5可知，與對照相比，當(dāng)培養(yǎng)基中添加0.10%的L-鳥氨酸鹽酸鹽時，阿斯青霉菌XK-12菌株的鐵載體產(chǎn)量明顯提高，產(chǎn)物質(zhì)量濃度最高達到0.106 mg/ml;當(dāng)培養(yǎng)基中加入0.10%的L-天冬氨酸時，XK-12菌株的鐵載體產(chǎn)量也有明顯提高，產(chǎn)物質(zhì)量濃度達到0.097 mg/ml;培養(yǎng)基中單獨添加L-谷氨酸時XK-12鐵載體產(chǎn)量最低;加L-鳥氨酸鹽酸鹽和L-谷氨酸的混合物時，鐵載體產(chǎn)量與對照相比無顯著差異;添加L-天冬氨酸和L-谷氨酸的混合物時，鐵載體產(chǎn)量與對照相比也無顯著差異。

2.3.4 不同鐵離子濃度對鐵載體產(chǎn)量的影響 由圖6可知，F(xiàn)e3+濃度能對XK-12鐵載體的產(chǎn)量產(chǎn)生顯著影響，在完全不添加Fe3+的培養(yǎng)基中，XK-12產(chǎn)鐵載體產(chǎn)量最高，能達到0.122 mg/ml。隨著鐵濃度的增加，XK-12菌株產(chǎn)鐵載體產(chǎn)量逐漸減少，這也反映了XK-12在低鐵條件下產(chǎn)鐵載體的特性。

2.4 裝液量對阿斯青霉菌XK-12產(chǎn)鐵載體的影響

由圖7可知，裝液量與XK-12菌株液態(tài)發(fā)酵鐵載體產(chǎn)量關(guān)系密切。隨著裝液量的逐漸增加，鐵載體產(chǎn)量先升高，在裝液量為70 ml時達到最高后下降。XK-12鐵載體產(chǎn)量最高為0.145 mg/ml。

2.5 初始pH對阿斯青霉菌XK-12產(chǎn)鐵載體的影響

由圖8可知，XK-12鐵載體的分泌隨著培養(yǎng)基初始pH的增大呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。XK-12菌株在發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH為5時鐵載體產(chǎn)量較低，pH為6時，XK-12菌株產(chǎn)鐵載體量最大，達到0.147 mg/ml，之后阿斯青霉菌XK-12產(chǎn)鐵載體能力隨著pH的增大逐漸降低，當(dāng)初始pH為9時，鐵載體的產(chǎn)量最低。

2.6 培養(yǎng)溫度對阿斯青霉菌XK-12產(chǎn)鐵載體的影響

由圖9可知，阿斯青霉菌XK-12在20～35 ℃培養(yǎng)均可產(chǎn)鐵載體;在20～28 ℃，隨著培養(yǎng)溫度的升高，鐵載體產(chǎn)量逐漸提高，當(dāng)培養(yǎng)溫度為28 ℃時，XK-12鐵載體產(chǎn)量最高，為0.156 mg/ml;28～35 ℃，隨著溫度升高鐵載體產(chǎn)量顯著下降。說明溫度在XK-12鐵載體分泌中有重要影響，在真菌的最適生長溫度范圍（25～30 ℃）內(nèi)，鐵載體產(chǎn)量較高，培養(yǎng)溫度為28 ℃時最利于XK-12產(chǎn)鐵載體。

2.7 不同條件下阿斯青霉菌XK-12鐵載體產(chǎn)量的時間曲線

由圖10可知，在3種不同條件下，在培養(yǎng)168 h時阿斯青霉菌XK-12鐵載體產(chǎn)量最高。添加L-鳥氨酸鹽酸鹽能大大提高XK-12產(chǎn)鐵載體產(chǎn)量，能達到0.173 mg/ml;而添加Fe3+則明顯降低了鐵載體的產(chǎn)量，僅為0.063 mg/ml。與對照相比，添加L-鳥氨酸鹽酸鹽能使XK-12鐵載體產(chǎn)量提高49.2%，而添加Fe3+使鐵載體產(chǎn)量下降了45.2%，進一步證明了培養(yǎng)基成分中Fe3+和L-鳥氨酸鹽酸鹽是影響XK-12產(chǎn)鐵載體的重要因素，與文獻[23]的結(jié)論相同。

2.8 阿斯青霉菌XK-12鐵載體發(fā)酵液對致病菌生長的影響

由圖11可以看出，阿斯青霉菌XK-12鐵載體發(fā)酵濾液對草莓根腐病病原菌Neofusicoccum kwambonambiense XKD-1具有較強的抑制作用，添加5%、10%、15%、20%鐵載體發(fā)酵液的PDA平板對XKD-1病原菌的抑制率分別為36.96%±0.01%、99.42%±0.12%、100%、100%，15%、20%鐵載體發(fā)酵液添加量與5%添加量和10%添加量之間差異顯著。隨著發(fā)酵液添加量的增加，XK-12鐵載體發(fā)酵液對病原菌XKD-1抑制率增大。在添加10%加Fe3+ XL-12鐵載體發(fā)酵液時，病原菌生長不受抑制，說明對病原菌XKD-1的抑制效果是XK-12鐵載體在起作用。

3 結(jié)論與討論

本試驗對阿斯青霉菌XK-12產(chǎn)鐵載體進行了研究，鑒定XK-12所產(chǎn)鐵載體為異肟羥酸型鐵載體。對影響XK-12鐵載體分泌的幾個影響因子進行了研究，發(fā)現(xiàn)碳、氮源種類及質(zhì)量分數(shù)、初始pH、溫度、裝液量、發(fā)酵時間對其鐵載體產(chǎn)量有顯著影響，且在低鐵脅迫下XK-12能產(chǎn)生更多的鐵載體，這種現(xiàn)象可能是微生物為了獲得足夠的鐵營養(yǎng)來為自身的生長營造有利環(huán)境，被迫啟動鐵載體轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，產(chǎn)生更多的鐵載體來競爭自然界中的鐵元素[19-20]。在本試驗中，添加0.10%的L-鳥氨酸鹽酸鹽能顯著提高XK-12鐵載體的產(chǎn)量，L-鳥氨酸鹽酸鹽是真菌合成異羥肟酸型鐵載體第1步的原料[21]，因此，L-鳥氨酸鹽酸鹽對XK-12菌株的鐵載體生產(chǎn)可能有重要的作用。Wang等[22]對海洋酵母HN6.2產(chǎn)鐵載體進行研究，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加Fe3+抑制了編碼鳥氨酸N5-加氧酶的羥化酶基因的表達，而在添加鳥氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的酵母細胞中羥化酶基因的表達增強。汪少林在對真菌鐵載體發(fā)酵條件的研究中發(fā)現(xiàn)固體發(fā)酵培養(yǎng)相較于液體發(fā)酵培養(yǎng)，粗提物的產(chǎn)出更高，幾種真菌中FECH-031產(chǎn)量最高，為32 mg/g，F(xiàn)ECH-050產(chǎn)量最低，為12 mg/g[23]。Wang等[22]在對海洋普魯蘭類酵母（Aureobasidium pullulans）HN6.2產(chǎn)鐵載體的培養(yǎng)基優(yōu)化中，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加鳥氨酸能顯著提高鐵載體的產(chǎn)量，同時添加Fe3+后明顯抑制了鐵載體的產(chǎn)量，在優(yōu)化后的最佳培養(yǎng)條件下，菌株最大鐵載體產(chǎn)量能達到1.1 mg/ml。

從抑菌試驗的結(jié)果可以看出，對照平板和10%加Fe3+ XK-12鐵載體發(fā)酵液平板上病原菌XKD-1生長情況幾乎一致，說明螯合足量鐵后的鐵載體失去了螯合平板中鐵離子的能力，病原菌生長所需的鐵元素未被奪去，可以正常生長。添加不同含量XK-12鐵載體發(fā)酵液的PDA平板對草莓根腐病病原菌Neofusicoccum kwambonambiense XKD-1有較強的抑制作用，且隨著發(fā)酵液用量的增大，抑制作用更明顯。由于微生物之間存在營養(yǎng)競爭[24-25]，生防微生物可以通過分泌具有螯合能力大于病原菌鐵載體的鐵載體來競爭土壤中微生物生長必需的的鐵元素，從而達到抑制病原菌生長的目的。張科立[26]從香蕉根際分離出內(nèi)生菌勞爾氏菌（Ralstonia sp.），發(fā)現(xiàn)該菌株產(chǎn)鐵載體能力強，通過平板對峙試驗對其抗病活性進行了評價，測得該菌對病原鐮刀菌的抑制率為73.2%。沈冰冰[27]在小麥和玉米種植地土壤中篩選出一株產(chǎn)鐵載體真菌YZ9，在平板拮抗試驗中，發(fā)現(xiàn)對玉米大斑病病原菌（Exserohilum tarcicum）和玉米莖腐病病原菌（Fusarium graminearum）的抑制率分別為64%和79%。趙榮艷等[8]從根際分離出一株產(chǎn)鐵載體真菌黃藍狀菌z-15（Talaromyces flavu），在體外試驗中，對蒜薹炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、水稻惡苗病菌（Fusarium moniliforme）、小麥根腐病菌（Bipolaris sorokiniana）3種病原菌均有一定拮抗效果，抑制率均超過20%，其發(fā)酵液對小麥根腐病菌的生長抑制效果較為顯著，最高抑制率達50.9%，并能有效抑制3種病原菌孢子萌發(fā)率，分別為100.0%、98.3%和81.2%。從根際分離到一株銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）FP6，其鐵載體對立枯絲核菌（Rhizoctonia Solani）和膠孢炭疽菌（Colletotrichum Gloeosporioides）作用明顯，但對膠孢子菌（C. gloeosporioides）無明顯抑制[8，28]。由此可見，鐵載體可以用于病原菌的防治，阿斯青霉菌XK-12在抗病促生長方面有著較大的應(yīng)用潛力。

參考文獻：

[1] HELL R， STEPHAN U W. Iron uptake， trafficking and homeostasis in plants [J]. Planta， 2003， 216（4）： 541-551.

[2] 劉艷萍，滕松山，趙 蕾. 高產(chǎn)嗜鐵素惡臭假單胞菌A3菌株的鑒定及其對黃瓜的促生作用[J]. 植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報， 2011， 17（6）： 1507-1514.

[3] 賈 凱，郭長虹. 高等植物體內(nèi)鐵運輸機制研究進展[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)， 2010， 29（6）： 1152-1158.

[4] HAAS D， DéFAGO G. Biological control of soil-borne pathogens by fluorescent pseudomonads [J]. Nature Reviews Microbiology， 2005， 3（4）： 307-319.

[5] KHAN A， SINGH P， SRIVASTAVA A. Synthesis， nature and utility of universal iron chelator-Siderophore： A review [J]. Microbiological Research， 2018， 212： 103-111.

[6] HIDER R C. Siderophore mediated absorption of iron [J]. Structure And Bonding， 1984， 58： 25-87.

[7] 孔維亮，周 敏，吳小芹. 水拉恩氏菌JZ-GX1產(chǎn)嗜鐵素特性及其對林木病原菌的拮抗作用[J]. 微生物學(xué)通報， 2019， 46（12）： 3278-3285.

[8] 趙榮艷，翟鳳艷. 嗜鐵真菌z-15對幾種病原菌的抑制作用[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2014， 42（10）： 127-129.

[9] SASIREKHA B， SRIVIDYA S. Siderophore production by Pseudomonas aeruginosa FP6， a biocontrol strain for Rhizoctonia solani and Colletotrichum gloeosporioides causing diseases in chilli [J]. Agriculture and Natural Resources， 2016， 50（4）： 250-256.

[10]SCHALK I J， HANNAUER M， BRAUD A. New roles for bacterial siderophores in metal transport and tolerance [J]. Environ Microbiol， 2011， 13（11）： 2844-2854.

[11]DAHLHEIMER S R， NEAL C R， FEIN J B. Potential mobilization of platinum-group elements by siderophores in surface environments [J]. Environ Sci Technol， 2007， 41（3）： 870-875.

[12]AHMED E， HOLMSTROM S J. Siderophores in environmental research： roles and applications [J]. Microb Biotechnol， 2014， 7（3）： 196-208.

[13]曾加會，李元媛，阮迪申，等. 植物根際促生菌及叢枝菌根真菌協(xié)助植物修復(fù)重金屬污染土壤的機制[J]. 微生物學(xué)通報， 2017， 44（5）： 1214-1221.

[14]劉 群. 缺鐵脅迫下棘孢木霉菌及其嗜鐵素對植物的促生機制研究 [D]. 濟南： 山東師范大學(xué)， 2017.

[15]NEILANDS J B. Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores[J]. Analytical Biochemstry， 1987， 160（1）： 47-56.

[16]ARNOW L E. Colorimetric determination of the components of 3，4-dihydroxyphenylalanine-tyrosine mixtures.[J]. Biological Chemistry，1937， 118（2）：531-537.

[17]LEONG S A， NEILANDS J B. Siderophore production by phytopathogenic microbial species [J].Arch Biochem Biophys，1982， 218（2）：351-359.

[18]SHENKER M，OLIVER I，HEBNANN M， et al. Utilization by tomatoes of iron mediated by a siderophore produced by Rhizopus arrhizus[J]. Journal of Plant Nutrition， 1992，15（10）： 2173-2182.

[19]NEILANDS J B. Siderophores： structure and function of microbial iron transport compounds [J]. Journal of Biological Chemistry， 1995， 270（45）： 26723-26726.

[20]張茜茜，朱慧明，楊肖靜，等. 枯草芽孢桿菌MB8兒茶酚型鐵載體的合成與結(jié)構(gòu)分析[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報， 2019，32（6）：1259-1266.

[21]HAAS H. Molecular genetics of fungal siderophore biosynthesis and uptake： the role of siderophores in iron uptake and storage [J]. Appl Microbiol Biotechnol， 2003， 62（4）： 316-330.

[22]WANG W， CHI Z， LIU G， et al. Chemical and biological characterization of siderophore produced by the marine-derived Aureobasidium pullulans HN6.2 and its antibacterial activity [J]. Biometals， 2009， 22（6）： 965-972.

[23]汪少林. 產(chǎn)鐵載體活性真菌篩選及鐵載體化合物對微生物群落結(jié)構(gòu)影響初步探究[D]. 昆明： 云南大學(xué)， 2017.

[24]鄧琳梅，楊 蕾，張俊星，等.云南省不同森林土壤中三七促生拮抗細菌的分離篩選[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，2020，51（1）：115-122.

[25]劉 琴，徐 健，祁建杭，等. 婁徹氏鏈霉菌SR-1102對番茄枯萎病的防效及根際微生物的影響[J] .江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2020，36（5）：1133-1138.

[26]張科立. 香蕉嗜鐵內(nèi)生細菌BEB3的分離鑒定及其生防機理初探[D]. ?？冢?海南大學(xué)， 2010.

[27]沈冰冰. 玉米莖腐病和大斑病生防菌的篩選及其促生作用的研究[D]. 哈爾濱： 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2019.

[28]SASIREKHA B， SRIVIDYA S. Siderophore production by Pseudomonas aeruginosa FP6， a biocontrol strain for Rhizoctonia solani and Colletotrichum gloeosporioides causing diseases in chilli [J]. Agriculture and Natural Resources， 2016， 50（4）： 250-256.

（責(zé)任編輯：張震林）

2975500783218