吳秋仙

(鹽城市亭湖區(qū)水產(chǎn)技術(shù)推廣站，江蘇 鹽城 224001)

鐵元素是大多生物體的必需元素之一，雖然地殼中鐵元素的含量占第4位，但是細菌可以吸收利用的游離Fe3+濃度極低。鐵離子以及鐵離子與蛋白質(zhì)結(jié)合，參與微生物體內(nèi)DNA的合成、過氧化物的降解、生物固氮等重要的生命活動過程(張瑩等，2012)。鐵載體(Siderophores)是由微生物(細菌、真菌)在低鐵環(huán)境中產(chǎn)生的一類低分子量、高親和力的鐵螯合劑，因其與許多細菌的致病性密切相關(guān)而引人注目。鐵載體能與鐵發(fā)生特異性的結(jié)合反應(yīng)，是細菌獲鐵系統(tǒng)的重要組成部分，它能夠幫助病原菌從宿主的鐵結(jié)合蛋白上獲得鐵，通過特異性的細胞膜受體將鐵轉(zhuǎn)移至細胞中，并參與細菌生長與代謝(Plowman等，1994)。

目前，已報道創(chuàng)傷弧菌、鰻弧菌、哈維氏弧菌、河流弧菌、副溶血弧菌等均能產(chǎn)生鐵載體，并且對所產(chǎn)生鐵載體的類型和結(jié)構(gòu)，以及鐵載體與外膜蛋白的關(guān)系進行了研究(馬向東等，1999)。本文研究了黃海希瓦氏菌AP629 在不同限鐵培養(yǎng)基中的生長情況，用CAS 檢測平板對AP629 的鐵載體進行定性研究，用CAS 液體培養(yǎng)法對AP629的鐵載體進行定量研究，比較了兩種培養(yǎng)方法鐵載體的產(chǎn)量，摸清了鐵載體產(chǎn)生的最佳條件，為鐵載體的類型及鐵載體與外膜蛋白的關(guān)系等深入研究奠定基礎(chǔ)。

一、材料和方法

1.材料

黃海希瓦氏菌(Shewanella smarflavi)AP629分離于大連地區(qū)患“化皮病”的仿刺參，由實驗室證實為病原菌，-80℃保存。黃海希瓦氏菌參考菌株KCCM41822由韓國釜慶大學(xué)疾病預(yù)防實驗室贈送。CAS 檢測平板：每100 毫升含20%蔗糖溶液l 毫升，10%酸水解酪素3 毫升，1 毫摩/升CaC12100 微 升，1 毫 摩/升MgSO42 毫 升，瓊 脂1.8 克，在約60℃時緩慢加入鹽溶液和CAS 染液各5毫升，即得藍色檢測培養(yǎng)基。所有溶液均用去離子水配制。按照Schwyn B等(1987)的方法配制CAS(鉻天青)染液且避光保存。

2.方法

(1)不同濃度螯合劑對細菌生長的影響。將黃海希瓦氏菌AP629和參考菌株接種于海水營養(yǎng)瓊脂(NA)上，28℃培養(yǎng)24 小時，將形成的細菌單菌落接種于含有2,2’－聯(lián)吡啶濃度為0、25、50、75、100、150、200、250、300 微摩/升的LB 和TSB 培養(yǎng)基中，28℃振蕩(180 轉(zhuǎn)/分)培養(yǎng)24 小時，用分光光度計測波長600納米處的吸光值。

(2)鐵載體的檢測。CAS 藍色染液是由絡(luò)天青、溴化十六碳烷基三甲銨和鐵離子組成的一種復(fù)合物，呈亮藍色。當(dāng)細菌產(chǎn)生鐵載體時，這種物質(zhì)會結(jié)合CAS 染液中的鐵離子，使其從CAS 藍色復(fù)合物中解離出來，失去鐵離子的CAS藍色檢測液的顏色會變?yōu)殚冱S色。由于顏色變化，630納米光密度變小，故鐵載體的量可通過CAS 比值來表示(馬國文等，1999)。CAS 比值：(對照－測量)/對照。對照組為未加螯合劑2,2’－聯(lián)吡啶、未加細菌的LB、TSB 培養(yǎng)基。測量組為加不同濃度螯合劑2,2’－聯(lián)吡啶及細菌的LB、TSB培養(yǎng)基。

(3)CAS 檢測平板上的定性檢測。將黃海希瓦氏菌AP629、參考菌株KCCM41822 以及大腸桿菌等參考菌株，用TSA(胰蛋白胨大豆瓊脂)培養(yǎng)基培養(yǎng)，接種后于28℃下培養(yǎng)24～48 小時；用三角刮刀將菌體刮下，PBS 重懸，并稀釋成5×106細胞/毫升菌液。取20 微升滴至CAS 檢測平板上，28℃下培養(yǎng)24 小時。在菌落的周圍固體平板由原來的亮藍色變?yōu)槌壬?，這種典型的顏色改變即是鐵載體分泌圈(Sohwyn B等，1987)。

(4)液體培養(yǎng)基中鐵載體的定量檢測。菌株上清液中鐵載體的檢測參考高磊等(2007)的方法進行。取培養(yǎng)獲得的黃海希瓦氏菌AP629和參考菌株KCCM41822 的菌懸液，12 000 轉(zhuǎn)/分離心10 分鐘，提取上清液與等量的CAS 染液混合，靜置數(shù)分鐘，用分光光度計測波長630納米處的吸光值。

二、結(jié)果與分析

1.不同濃度螯合劑對細菌生長的影響

黃海希瓦氏菌在TSB、LB 中限鐵生長見圖1、圖2。在TSB 培養(yǎng)基中兩株菌隨著2,2’－聯(lián)吡啶濃度的漸增先迅速上升，后逐漸下降，兩株菌在2,2’－聯(lián)吡啶濃度為25微摩/升時均生長最旺盛，當(dāng)2,2’－聯(lián)吡啶的濃度達到300 微摩/升時，黃海希瓦氏菌AP629 和參考菌株KCCM41822 幾乎不生長。在LB 培養(yǎng)基中，兩株菌的生長量低于TSB 中的生長量，隨著2,2’－聯(lián)吡啶濃度的漸增，生長量逐漸降低，黃海希瓦氏菌AP629 和參考菌株KCCM41822 在2,2’－聯(lián)吡啶濃度為50、100 微摩/升時均生長最旺盛，當(dāng)2,2’－聯(lián)吡啶的濃度達到300 微摩/升時，黃海希瓦氏菌AP629 和參考菌株KCCM41822幾乎不生長。菌株在加入一定濃度的螯合劑后，會促進它的生長。

圖1 黃海希瓦氏菌在TSB中限鐵生長

圖2 黃海希瓦氏菌在LB中限鐵生長

2.鐵載體的檢測

(1)CAS 檢測平板上的定性檢測。結(jié)果表明，在菌落的周圍固體平板由亮藍色變?yōu)槌壬@種典型的顏色改變即是鐵載體分泌圈所致。從圖3A(1-2，3-4)可以看出，黃海希瓦氏菌AP629和參考菌株菌落的周圍變成橙色，表明兩株菌能夠產(chǎn)生鐵載體；圖3B(1-2)大腸桿菌菌落周圍的橙色較大，說明分泌的鐵載體較多。從圖3C(3-4)可見，假單胞菌在CAS 檢測平板上不能生長；從圖3C、圖3D 可見，溶藻弧菌和嗜水氣單胞菌較遲鈍愛德華氏菌的鐵載體分泌圈稍小。

圖3 不同菌株鐵載體形成能力比較

(2)液體培養(yǎng)基中鐵載體的定量檢測。鐵載體的產(chǎn)生是通過藍色染液的顏色變化來觀察的。本試驗用TSB培養(yǎng)基發(fā)現(xiàn)不同濃度螯合劑對培養(yǎng)基的顏色產(chǎn)生了影響，使培養(yǎng)基的顏色略微呈現(xiàn)橘黃色，如圖4 所示，干擾了結(jié)果的觀察，因此，TSB不宜作為檢測鐵載體的培養(yǎng)基。

圖4 不同濃度2,2’－聯(lián)吡啶TSB上清液中鐵載體檢測

兩株菌在LB 培養(yǎng)基上清液中分泌的鐵載體產(chǎn)量如圖5所示。AP629在2,2’－聯(lián)吡啶濃度為50微摩/升時鐵載體產(chǎn)量最高，參考菌株在100微摩/升時鐵載體產(chǎn)量最高。

圖5 LB培養(yǎng)基中鐵載體檢測

三、討論

本文研究了不同濃度螯合劑2,2’－聯(lián)吡啶對黃海希瓦氏菌AP629和參考菌株生長以及鐵載體產(chǎn)生的影響。結(jié)果表明，培養(yǎng)基中加入2,2’－聯(lián)吡啶后螯合了環(huán)境中的鐵，細菌若沒有產(chǎn)生鐵載體其生長量必然減少，而試驗結(jié)果細菌數(shù)量反而增加，說明了黃海希瓦氏菌AP629和參考菌株為了在限鐵環(huán)境中生存，已經(jīng)產(chǎn)生了鐵載體，以利于自身的生長。在TSB 培養(yǎng)基中，黃海希瓦氏菌AP629和參考菌株的產(chǎn)鐵載體的界限濃度都是50微摩/升；在LB培養(yǎng)基中，兩株菌的產(chǎn)鐵載體的界限濃度分別是100、200微摩/升。當(dāng)環(huán)境中鐵離子濃度越高，越能通過非特異性系統(tǒng)攝取鐵營養(yǎng)，而只有在鐵營養(yǎng)不足時，細菌才合成鐵載體來攝取鐵。這些現(xiàn)象說明在黃海希瓦氏菌的生長中，鐵這一營養(yǎng)因素扮演了重要的角色。

本文采用了Sohwyn B 等(1987)的固體平板檢測法來檢測菌株的產(chǎn)鐵載體的能力。結(jié)果表明，黃海希瓦氏菌AP629 和參考菌株能夠產(chǎn)生鐵載體；大腸桿菌菌落周圍的橙色圈較大，從而得出其能分泌較多的鐵載體；假單胞菌在CAS檢測平板上不能生長，可能是合成鐵載體量較少的細菌由于體系中的Fe3+受到更強的限制，從而生長受到抑制；溶藻弧菌和嗜水氣單胞菌較遲鈍愛德華氏菌的鐵載體分泌圈稍小。本文結(jié)果表明，不同菌種對于鐵離子濃度的要求是有差異的，產(chǎn)生鐵載體的能力也是有所不同的。

在對兩株菌進行液體培養(yǎng)基檢測時發(fā)現(xiàn)，TSB不宜作為檢測鐵載體的培養(yǎng)基，本試驗采用了LB培養(yǎng)基。檢測黃海希瓦氏菌AP629 和參考菌株KCCM41822在LB培養(yǎng)基上清液中的鐵載體含量，結(jié)果表明，黃海希瓦氏菌AP629在2,2’－聯(lián)吡啶濃度為50 微摩/升時鐵載體產(chǎn)量最高，參考菌株KCCM41822在100微摩/升時鐵載體產(chǎn)量最高。