吳秋仙

(鹽城市亭湖區(qū)水產(chǎn)技術(shù)推廣站，江蘇 鹽城 224001)

鐵元素是大多生物體的必需元素之一，雖然地殼中鐵元素的含量占第4位，但是細(xì)菌可以吸收利用的游離Fe3+濃度極低。鐵離子以及鐵離子與蛋白質(zhì)結(jié)合，參與微生物體內(nèi)DNA的合成、過(guò)氧化物的降解、生物固氮等重要的生命活動(dòng)過(guò)程(張瑩等，2012)。鐵載體(Siderophores)是由微生物(細(xì)菌、真菌)在低鐵環(huán)境中產(chǎn)生的一類低分子量、高親和力的鐵螯合劑，因其與許多細(xì)菌的致病性密切相關(guān)而引人注目。鐵載體能與鐵發(fā)生特異性的結(jié)合反應(yīng)，是細(xì)菌獲鐵系統(tǒng)的重要組成部分，它能夠幫助病原菌從宿主的鐵結(jié)合蛋白上獲得鐵，通過(guò)特異性的細(xì)胞膜受體將鐵轉(zhuǎn)移至細(xì)胞中，并參與細(xì)菌生長(zhǎng)與代謝(Plowman等，1994)。

目前，已報(bào)道創(chuàng)傷弧菌、鰻弧菌、哈維氏弧菌、河流弧菌、副溶血弧菌等均能產(chǎn)生鐵載體，并且對(duì)所產(chǎn)生鐵載體的類型和結(jié)構(gòu)，以及鐵載體與外膜蛋白的關(guān)系進(jìn)行了研究(馬向東等，1999)。本文研究了黃海希瓦氏菌AP629 在不同限鐵培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況，用CAS 檢測(cè)平板對(duì)AP629 的鐵載體進(jìn)行定性研究，用CAS 液體培養(yǎng)法對(duì)AP629的鐵載體進(jìn)行定量研究，比較了兩種培養(yǎng)方法鐵載體的產(chǎn)量，摸清了鐵載體產(chǎn)生的最佳條件，為鐵載體的類型及鐵載體與外膜蛋白的關(guān)系等深入研究奠定基礎(chǔ)。

一、材料和方法

1.材料

黃海希瓦氏菌(Shewanella smarflavi)AP629分離于大連地區(qū)患“化皮病”的仿刺參，由實(shí)驗(yàn)室證實(shí)為病原菌，-80℃保存。黃海希瓦氏菌參考菌株KCCM41822由韓國(guó)釜慶大學(xué)疾病預(yù)防實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送。CAS 檢測(cè)平板：每100 毫升含20%蔗糖溶液l 毫升，10%酸水解酪素3 毫升，1 毫摩/升CaC12100 微 升，1 毫 摩/升MgSO42 毫 升，瓊 脂1.8 克，在約60℃時(shí)緩慢加入鹽溶液和CAS 染液各5毫升，即得藍(lán)色檢測(cè)培養(yǎng)基。所有溶液均用去離子水配制。按照Schwyn B等(1987)的方法配制CAS(鉻天青)染液且避光保存。

2.方法

(1)不同濃度螯合劑對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響。將黃海希瓦氏菌AP629和參考菌株接種于海水營(yíng)養(yǎng)瓊脂(NA)上，28℃培養(yǎng)24 小時(shí)，將形成的細(xì)菌單菌落接種于含有2,2’－聯(lián)吡啶濃度為0、25、50、75、100、150、200、250、300 微摩/升的LB 和TSB 培養(yǎng)基中，28℃振蕩(180 轉(zhuǎn)/分)培養(yǎng)24 小時(shí)，用分光光度計(jì)測(cè)波長(zhǎng)600納米處的吸光值。

(2)鐵載體的檢測(cè)。CAS 藍(lán)色染液是由絡(luò)天青、溴化十六碳烷基三甲銨和鐵離子組成的一種復(fù)合物，呈亮藍(lán)色。當(dāng)細(xì)菌產(chǎn)生鐵載體時(shí)，這種物質(zhì)會(huì)結(jié)合CAS 染液中的鐵離子，使其從CAS 藍(lán)色復(fù)合物中解離出來(lái)，失去鐵離子的CAS藍(lán)色檢測(cè)液的顏色會(huì)變?yōu)殚冱S色。由于顏色變化，630納米光密度變小，故鐵載體的量可通過(guò)CAS 比值來(lái)表示(馬國(guó)文等，1999)。CAS 比值：(對(duì)照－測(cè)量)/對(duì)照。對(duì)照組為未加螯合劑2,2’－聯(lián)吡啶、未加細(xì)菌的LB、TSB 培養(yǎng)基。測(cè)量組為加不同濃度螯合劑2,2’－聯(lián)吡啶及細(xì)菌的LB、TSB培養(yǎng)基。

(3)CAS 檢測(cè)平板上的定性檢測(cè)。將黃海希瓦氏菌AP629、參考菌株KCCM41822 以及大腸桿菌等參考菌株，用TSA(胰蛋白胨大豆瓊脂)培養(yǎng)基培養(yǎng)，接種后于28℃下培養(yǎng)24～48 小時(shí)；用三角刮刀將菌體刮下，PBS 重懸，并稀釋成5×106細(xì)胞/毫升菌液。取20 微升滴至CAS 檢測(cè)平板上，28℃下培養(yǎng)24 小時(shí)。在菌落的周圍固體平板由原來(lái)的亮藍(lán)色變?yōu)槌壬?，這種典型的顏色改變即是鐵載體分泌圈(Sohwyn B等，1987)。

(4)液體培養(yǎng)基中鐵載體的定量檢測(cè)。菌株上清液中鐵載體的檢測(cè)參考高磊等(2007)的方法進(jìn)行。取培養(yǎng)獲得的黃海希瓦氏菌AP629和參考菌株KCCM41822 的菌懸液，12 000 轉(zhuǎn)/分離心10 分鐘，提取上清液與等量的CAS 染液混合，靜置數(shù)分鐘，用分光光度計(jì)測(cè)波長(zhǎng)630納米處的吸光值。

二、結(jié)果與分析

1.不同濃度螯合劑對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響

黃海希瓦氏菌在TSB、LB 中限鐵生長(zhǎng)見(jiàn)圖1、圖2。在TSB 培養(yǎng)基中兩株菌隨著2,2’－聯(lián)吡啶濃度的漸增先迅速上升，后逐漸下降，兩株菌在2,2’－聯(lián)吡啶濃度為25微摩/升時(shí)均生長(zhǎng)最旺盛，當(dāng)2,2’－聯(lián)吡啶的濃度達(dá)到300 微摩/升時(shí)，黃海希瓦氏菌AP629 和參考菌株KCCM41822 幾乎不生長(zhǎng)。在LB 培養(yǎng)基中，兩株菌的生長(zhǎng)量低于TSB 中的生長(zhǎng)量，隨著2,2’－聯(lián)吡啶濃度的漸增，生長(zhǎng)量逐漸降低，黃海希瓦氏菌AP629 和參考菌株KCCM41822 在2,2’－聯(lián)吡啶濃度為50、100 微摩/升時(shí)均生長(zhǎng)最旺盛，當(dāng)2,2’－聯(lián)吡啶的濃度達(dá)到300 微摩/升時(shí)，黃海希瓦氏菌AP629 和參考菌株KCCM41822幾乎不生長(zhǎng)。菌株在加入一定濃度的螯合劑后，會(huì)促進(jìn)它的生長(zhǎng)。

圖1 黃海希瓦氏菌在TSB中限鐵生長(zhǎng)

圖2 黃海希瓦氏菌在LB中限鐵生長(zhǎng)

2.鐵載體的檢測(cè)

(1)CAS 檢測(cè)平板上的定性檢測(cè)。結(jié)果表明，在菌落的周圍固體平板由亮藍(lán)色變?yōu)槌壬?，這種典型的顏色改變即是鐵載體分泌圈所致。從圖3A(1-2，3-4)可以看出，黃海希瓦氏菌AP629和參考菌株菌落的周圍變成橙色，表明兩株菌能夠產(chǎn)生鐵載體；圖3B(1-2)大腸桿菌菌落周圍的橙色較大，說(shuō)明分泌的鐵載體較多。從圖3C(3-4)可見(jiàn)，假單胞菌在CAS 檢測(cè)平板上不能生長(zhǎng)；從圖3C、圖3D 可見(jiàn)，溶藻弧菌和嗜水氣單胞菌較遲鈍愛(ài)德華氏菌的鐵載體分泌圈稍小。

圖3 不同菌株鐵載體形成能力比較

(2)液體培養(yǎng)基中鐵載體的定量檢測(cè)。鐵載體的產(chǎn)生是通過(guò)藍(lán)色染液的顏色變化來(lái)觀察的。本試驗(yàn)用TSB培養(yǎng)基發(fā)現(xiàn)不同濃度螯合劑對(duì)培養(yǎng)基的顏色產(chǎn)生了影響，使培養(yǎng)基的顏色略微呈現(xiàn)橘黃色，如圖4 所示，干擾了結(jié)果的觀察，因此，TSB不宜作為檢測(cè)鐵載體的培養(yǎng)基。

圖4 不同濃度2,2’－聯(lián)吡啶TSB上清液中鐵載體檢測(cè)

兩株菌在LB 培養(yǎng)基上清液中分泌的鐵載體產(chǎn)量如圖5所示。AP629在2,2’－聯(lián)吡啶濃度為50微摩/升時(shí)鐵載體產(chǎn)量最高，參考菌株在100微摩/升時(shí)鐵載體產(chǎn)量最高。

圖5 LB培養(yǎng)基中鐵載體檢測(cè)

三、討論

本文研究了不同濃度螯合劑2,2’－聯(lián)吡啶對(duì)黃海希瓦氏菌AP629和參考菌株生長(zhǎng)以及鐵載體產(chǎn)生的影響。結(jié)果表明，培養(yǎng)基中加入2,2’－聯(lián)吡啶后螯合了環(huán)境中的鐵，細(xì)菌若沒(méi)有產(chǎn)生鐵載體其生長(zhǎng)量必然減少，而試驗(yàn)結(jié)果細(xì)菌數(shù)量反而增加，說(shuō)明了黃海希瓦氏菌AP629和參考菌株為了在限鐵環(huán)境中生存，已經(jīng)產(chǎn)生了鐵載體，以利于自身的生長(zhǎng)。在TSB 培養(yǎng)基中，黃海希瓦氏菌AP629和參考菌株的產(chǎn)鐵載體的界限濃度都是50微摩/升；在LB培養(yǎng)基中，兩株菌的產(chǎn)鐵載體的界限濃度分別是100、200微摩/升。當(dāng)環(huán)境中鐵離子濃度越高，越能通過(guò)非特異性系統(tǒng)攝取鐵營(yíng)養(yǎng)，而只有在鐵營(yíng)養(yǎng)不足時(shí)，細(xì)菌才合成鐵載體來(lái)攝取鐵。這些現(xiàn)象說(shuō)明在黃海希瓦氏菌的生長(zhǎng)中，鐵這一營(yíng)養(yǎng)因素扮演了重要的角色。

本文采用了Sohwyn B 等(1987)的固體平板檢測(cè)法來(lái)檢測(cè)菌株的產(chǎn)鐵載體的能力。結(jié)果表明，黃海希瓦氏菌AP629 和參考菌株能夠產(chǎn)生鐵載體；大腸桿菌菌落周圍的橙色圈較大，從而得出其能分泌較多的鐵載體；假單胞菌在CAS檢測(cè)平板上不能生長(zhǎng)，可能是合成鐵載體量較少的細(xì)菌由于體系中的Fe3+受到更強(qiáng)的限制，從而生長(zhǎng)受到抑制；溶藻弧菌和嗜水氣單胞菌較遲鈍愛(ài)德華氏菌的鐵載體分泌圈稍小。本文結(jié)果表明，不同菌種對(duì)于鐵離子濃度的要求是有差異的，產(chǎn)生鐵載體的能力也是有所不同的。

在對(duì)兩株菌進(jìn)行液體培養(yǎng)基檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)，TSB不宜作為檢測(cè)鐵載體的培養(yǎng)基，本試驗(yàn)采用了LB培養(yǎng)基。檢測(cè)黃海希瓦氏菌AP629 和參考菌株KCCM41822在LB培養(yǎng)基上清液中的鐵載體含量，結(jié)果表明，黃海希瓦氏菌AP629在2,2’－聯(lián)吡啶濃度為50 微摩/升時(shí)鐵載體產(chǎn)量最高，參考菌株KCCM41822在100微摩/升時(shí)鐵載體產(chǎn)量最高。