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        黃海希瓦氏菌鐵載體及其產(chǎn)生條件研究

        2021-05-19 09:05:10吳秋仙
        科學養(yǎng)魚 2021年4期
        關鍵詞:鐵載體希瓦聯(lián)吡啶

        吳秋仙

        (鹽城市亭湖區(qū)水產(chǎn)技術推廣站,江蘇 鹽城 224001)

        鐵元素是大多生物體的必需元素之一,雖然地殼中鐵元素的含量占第4位,但是細菌可以吸收利用的游離Fe3+濃度極低。鐵離子以及鐵離子與蛋白質結合,參與微生物體內DNA的合成、過氧化物的降解、生物固氮等重要的生命活動過程(張瑩等,2012)。鐵載體(Siderophores)是由微生物(細菌、真菌)在低鐵環(huán)境中產(chǎn)生的一類低分子量、高親和力的鐵螯合劑,因其與許多細菌的致病性密切相關而引人注目。鐵載體能與鐵發(fā)生特異性的結合反應,是細菌獲鐵系統(tǒng)的重要組成部分,它能夠幫助病原菌從宿主的鐵結合蛋白上獲得鐵,通過特異性的細胞膜受體將鐵轉移至細胞中,并參與細菌生長與代謝(Plowman等,1994)。

        目前,已報道創(chuàng)傷弧菌、鰻弧菌、哈維氏弧菌、河流弧菌、副溶血弧菌等均能產(chǎn)生鐵載體,并且對所產(chǎn)生鐵載體的類型和結構,以及鐵載體與外膜蛋白的關系進行了研究(馬向東等,1999)。本文研究了黃海希瓦氏菌AP629 在不同限鐵培養(yǎng)基中的生長情況,用CAS 檢測平板對AP629 的鐵載體進行定性研究,用CAS 液體培養(yǎng)法對AP629的鐵載體進行定量研究,比較了兩種培養(yǎng)方法鐵載體的產(chǎn)量,摸清了鐵載體產(chǎn)生的最佳條件,為鐵載體的類型及鐵載體與外膜蛋白的關系等深入研究奠定基礎。

        一、材料和方法

        1.材料

        黃海希瓦氏菌(Shewanella smarflavi)AP629分離于大連地區(qū)患“化皮病”的仿刺參,由實驗室證實為病原菌,-80℃保存。黃海希瓦氏菌參考菌株KCCM41822由韓國釜慶大學疾病預防實驗室贈送。CAS 檢測平板:每100 毫升含20%蔗糖溶液l 毫升,10%酸水解酪素3 毫升,1 毫摩/升CaC12100 微 升,1 毫 摩/升MgSO42 毫 升,瓊 脂1.8 克,在約60℃時緩慢加入鹽溶液和CAS 染液各5毫升,即得藍色檢測培養(yǎng)基。所有溶液均用去離子水配制。按照Schwyn B等(1987)的方法配制CAS(鉻天青)染液且避光保存。

        2.方法

        (1)不同濃度螯合劑對細菌生長的影響。將黃海希瓦氏菌AP629和參考菌株接種于海水營養(yǎng)瓊脂(NA)上,28℃培養(yǎng)24 小時,將形成的細菌單菌落接種于含有2,2’-聯(lián)吡啶濃度為0、25、50、75、100、150、200、250、300 微摩/升的LB 和TSB 培養(yǎng)基中,28℃振蕩(180 轉/分)培養(yǎng)24 小時,用分光光度計測波長600納米處的吸光值。

        (2)鐵載體的檢測。CAS 藍色染液是由絡天青、溴化十六碳烷基三甲銨和鐵離子組成的一種復合物,呈亮藍色。當細菌產(chǎn)生鐵載體時,這種物質會結合CAS 染液中的鐵離子,使其從CAS 藍色復合物中解離出來,失去鐵離子的CAS藍色檢測液的顏色會變?yōu)殚冱S色。由于顏色變化,630納米光密度變小,故鐵載體的量可通過CAS 比值來表示(馬國文等,1999)。CAS 比值:(對照-測量)/對照。對照組為未加螯合劑2,2’-聯(lián)吡啶、未加細菌的LB、TSB 培養(yǎng)基。測量組為加不同濃度螯合劑2,2’-聯(lián)吡啶及細菌的LB、TSB培養(yǎng)基。

        (3)CAS 檢測平板上的定性檢測。將黃海希瓦氏菌AP629、參考菌株KCCM41822 以及大腸桿菌等參考菌株,用TSA(胰蛋白胨大豆瓊脂)培養(yǎng)基培養(yǎng),接種后于28℃下培養(yǎng)24~48 小時;用三角刮刀將菌體刮下,PBS 重懸,并稀釋成5×106細胞/毫升菌液。取20 微升滴至CAS 檢測平板上,28℃下培養(yǎng)24 小時。在菌落的周圍固體平板由原來的亮藍色變?yōu)槌壬@種典型的顏色改變即是鐵載體分泌圈(Sohwyn B等,1987)。

        (4)液體培養(yǎng)基中鐵載體的定量檢測。菌株上清液中鐵載體的檢測參考高磊等(2007)的方法進行。取培養(yǎng)獲得的黃海希瓦氏菌AP629和參考菌株KCCM41822 的菌懸液,12 000 轉/分離心10 分鐘,提取上清液與等量的CAS 染液混合,靜置數(shù)分鐘,用分光光度計測波長630納米處的吸光值。

        二、結果與分析

        1.不同濃度螯合劑對細菌生長的影響

        黃海希瓦氏菌在TSB、LB 中限鐵生長見圖1、圖2。在TSB 培養(yǎng)基中兩株菌隨著2,2’-聯(lián)吡啶濃度的漸增先迅速上升,后逐漸下降,兩株菌在2,2’-聯(lián)吡啶濃度為25微摩/升時均生長最旺盛,當2,2’-聯(lián)吡啶的濃度達到300 微摩/升時,黃海希瓦氏菌AP629 和參考菌株KCCM41822 幾乎不生長。在LB 培養(yǎng)基中,兩株菌的生長量低于TSB 中的生長量,隨著2,2’-聯(lián)吡啶濃度的漸增,生長量逐漸降低,黃海希瓦氏菌AP629 和參考菌株KCCM41822 在2,2’-聯(lián)吡啶濃度為50、100 微摩/升時均生長最旺盛,當2,2’-聯(lián)吡啶的濃度達到300 微摩/升時,黃海希瓦氏菌AP629 和參考菌株KCCM41822幾乎不生長。菌株在加入一定濃度的螯合劑后,會促進它的生長。

        圖1 黃海希瓦氏菌在TSB中限鐵生長

        圖2 黃海希瓦氏菌在LB中限鐵生長

        2.鐵載體的檢測

        (1)CAS 檢測平板上的定性檢測。結果表明,在菌落的周圍固體平板由亮藍色變?yōu)槌壬?,這種典型的顏色改變即是鐵載體分泌圈所致。從圖3A(1-2,3-4)可以看出,黃海希瓦氏菌AP629和參考菌株菌落的周圍變成橙色,表明兩株菌能夠產(chǎn)生鐵載體;圖3B(1-2)大腸桿菌菌落周圍的橙色較大,說明分泌的鐵載體較多。從圖3C(3-4)可見,假單胞菌在CAS 檢測平板上不能生長;從圖3C、圖3D 可見,溶藻弧菌和嗜水氣單胞菌較遲鈍愛德華氏菌的鐵載體分泌圈稍小。

        圖3 不同菌株鐵載體形成能力比較

        (2)液體培養(yǎng)基中鐵載體的定量檢測。鐵載體的產(chǎn)生是通過藍色染液的顏色變化來觀察的。本試驗用TSB培養(yǎng)基發(fā)現(xiàn)不同濃度螯合劑對培養(yǎng)基的顏色產(chǎn)生了影響,使培養(yǎng)基的顏色略微呈現(xiàn)橘黃色,如圖4 所示,干擾了結果的觀察,因此,TSB不宜作為檢測鐵載體的培養(yǎng)基。

        圖4 不同濃度2,2’-聯(lián)吡啶TSB上清液中鐵載體檢測

        兩株菌在LB 培養(yǎng)基上清液中分泌的鐵載體產(chǎn)量如圖5所示。AP629在2,2’-聯(lián)吡啶濃度為50微摩/升時鐵載體產(chǎn)量最高,參考菌株在100微摩/升時鐵載體產(chǎn)量最高。

        圖5 LB培養(yǎng)基中鐵載體檢測

        三、討論

        本文研究了不同濃度螯合劑2,2’-聯(lián)吡啶對黃海希瓦氏菌AP629和參考菌株生長以及鐵載體產(chǎn)生的影響。結果表明,培養(yǎng)基中加入2,2’-聯(lián)吡啶后螯合了環(huán)境中的鐵,細菌若沒有產(chǎn)生鐵載體其生長量必然減少,而試驗結果細菌數(shù)量反而增加,說明了黃海希瓦氏菌AP629和參考菌株為了在限鐵環(huán)境中生存,已經(jīng)產(chǎn)生了鐵載體,以利于自身的生長。在TSB 培養(yǎng)基中,黃海希瓦氏菌AP629和參考菌株的產(chǎn)鐵載體的界限濃度都是50微摩/升;在LB培養(yǎng)基中,兩株菌的產(chǎn)鐵載體的界限濃度分別是100、200微摩/升。當環(huán)境中鐵離子濃度越高,越能通過非特異性系統(tǒng)攝取鐵營養(yǎng),而只有在鐵營養(yǎng)不足時,細菌才合成鐵載體來攝取鐵。這些現(xiàn)象說明在黃海希瓦氏菌的生長中,鐵這一營養(yǎng)因素扮演了重要的角色。

        本文采用了Sohwyn B 等(1987)的固體平板檢測法來檢測菌株的產(chǎn)鐵載體的能力。結果表明,黃海希瓦氏菌AP629 和參考菌株能夠產(chǎn)生鐵載體;大腸桿菌菌落周圍的橙色圈較大,從而得出其能分泌較多的鐵載體;假單胞菌在CAS檢測平板上不能生長,可能是合成鐵載體量較少的細菌由于體系中的Fe3+受到更強的限制,從而生長受到抑制;溶藻弧菌和嗜水氣單胞菌較遲鈍愛德華氏菌的鐵載體分泌圈稍小。本文結果表明,不同菌種對于鐵離子濃度的要求是有差異的,產(chǎn)生鐵載體的能力也是有所不同的。

        在對兩株菌進行液體培養(yǎng)基檢測時發(fā)現(xiàn),TSB不宜作為檢測鐵載體的培養(yǎng)基,本試驗采用了LB培養(yǎng)基。檢測黃海希瓦氏菌AP629 和參考菌株KCCM41822在LB培養(yǎng)基上清液中的鐵載體含量,結果表明,黃海希瓦氏菌AP629在2,2’-聯(lián)吡啶濃度為50 微摩/升時鐵載體產(chǎn)量最高,參考菌株KCCM41822在100微摩/升時鐵載體產(chǎn)量最高。

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