潘亞菲，趙志軍，黨甜甜，陳 梅，馬 苗，賈 偉

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，銀川 750004；3.寧夏病原微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750004）

肺炎克雷伯菌（Klebsiella.peneumoniae，Kpn）作為臨床常見(jiàn)的條件致病菌，在宿主免疫力低下或伴發(fā)基礎(chǔ)疾病時(shí)可以引起呼吸道、消化道和泌尿生殖道等感染，分布廣泛?，F(xiàn)今，Kpn的耐藥問(wèn)題變得愈加嚴(yán)峻[1]，其中耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌（Carbapenem-resistant klebsiella pneumoniae，CRKP）因傳播效率高、難以治愈且致死率高等特點(diǎn)受到廣泛關(guān)注。根據(jù)我國(guó)最新耐藥監(jiān)測(cè)結(jié)果報(bào)道[2]，Kpn對(duì)碳青霉烯類藥物的耐藥率已超過(guò)20%。由細(xì)菌合成和分泌的一種低分子量分子稱為鐵載體，它可以通過(guò)周圍環(huán)境螯合鐵，促進(jìn)細(xì)菌對(duì)鐵的吸收，進(jìn)而參與細(xì)菌代謝與生長(zhǎng)[3]。研究[4]發(fā)現(xiàn)，鐵載體可作為受體將抗生素分子轉(zhuǎn)入細(xì)菌內(nèi)，從而影響細(xì)菌的耐藥性。據(jù)報(bào)道[5]，Kpn對(duì)喹諾酮類、頭孢類耐藥程度與鐵載體產(chǎn)量相關(guān)。探究Kpn鐵載體與碳青霉烯類藥物耐藥性的研究仍較少[6]。因此，本研究通過(guò)對(duì)Kpn產(chǎn)鐵載體能力分析、常見(jiàn)耐藥基因和鐵載體基因的檢測(cè)以及CRKP菌株產(chǎn)酶型的鑒定等，探討目前CRKP菌株的流行情況，并分析碳青霉烯類抗生素耐藥性與Kpn產(chǎn)鐵載體能力的關(guān)系，以期為臨床解決抗生素耐藥問(wèn)題提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

本研究所使用的60株Kpn均來(lái)自2019年寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院臨床收集，全部菌株分離純化。使用的所有菌株都通過(guò)了VITEK2Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)的鑒定。標(biāo)準(zhǔn)菌株為肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705、ATCC BAA-1706和大腸埃希菌ATCC25922。

1.2 鉻天青S（CAS）平板檢測(cè)

將CAS平板四分區(qū)，分別加入10 μL菌液在CAS檢測(cè)板上，待菌液干燥后放入培養(yǎng)箱，37℃培養(yǎng)18～24 h。若經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后的菌落周圍呈現(xiàn)橘黃色分泌環(huán)，表明有鐵載體的產(chǎn)生。

1.3 嗜鐵素相對(duì)含量測(cè)定

制備菌懸液，紫外分光光度法檢測(cè)得到鐵載體的相對(duì)含量。將臨床分離的60株Kpn以10 000 r·min-1速度離心10 min，再取上清3 mL與CAS檢測(cè)液等體積混合，在黑暗中放置30 min，以雙蒸水為對(duì)照，將630 nm處的吸光度（As）調(diào)整為零。將空白介質(zhì)與等量的CAS檢測(cè)液混合，以其吸光度（Ar）值為參比，按公式［（Ar-As）/Ar］×100%計(jì)算，得到不同的鐵載體含量。根據(jù)鐵載體總含量的中位數(shù)，將菌株分為高產(chǎn)鐵載體組和低產(chǎn)鐵載體組，每組細(xì)菌均為30株。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 基因擴(kuò)增

通過(guò)煮沸法提取細(xì)菌DNA，PCR檢測(cè)相應(yīng)的鐵載體基因和碳青霉烯類耐藥基因。本研究中所使用引物由上海生工生物工程有限公司合成，其擴(kuò)增體系為20 μL，在這其中包括2×Taq DNA Mix酶10 μL，模板1 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 7 μL。反應(yīng)條件為：94℃下5 min，94℃下60 s，退火60 s（見(jiàn)表1），72℃下60 s，循環(huán)32次，72℃下10 min。用10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳觀察產(chǎn)物。

表1 PCR引物序列

1.5 藥敏實(shí)驗(yàn)

根據(jù)CLSI 2018年M100-S28文件檢測(cè)步驟，將美羅培南藥敏紙片浸沒(méi)于菌懸液中，以浸于無(wú)菌水中的美羅培南藥敏紙片作為空白對(duì)照。以KpnATCC BAA-1705菌液中的美羅培南藥敏紙片作為絲氨酸碳青霉烯酶陽(yáng)性對(duì)照，KpnATCC BAA-1706作為碳青霉烯酶陰性對(duì)照。測(cè)量抑菌圈大小，進(jìn)行結(jié)果判讀。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。60株Kpn鐵載體含量呈偏態(tài)分布，根據(jù)中位數(shù)進(jìn)行分組，兩組Kpn鐵載體含量分別呈正態(tài)分布，組間比較采用雙樣本獨(dú)立t檢驗(yàn)；高產(chǎn)鐵載體組與低產(chǎn)鐵載體組對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥性的差異、耐藥基因和鐵載體基因陽(yáng)性率差異比較采用χ2檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Kpn鐵載體產(chǎn)量結(jié)果

鐵載體含量測(cè)定表明，60株Kpn均產(chǎn)生橘黃色分泌環(huán)，說(shuō)明都產(chǎn)生鐵載體，且由于分泌環(huán)的直徑不同，各菌株產(chǎn)生的鐵載體數(shù)量也不同。用酶標(biāo)儀定量檢測(cè)細(xì)菌鐵載體含量，獲得60株Kpn鐵載體含量范圍為（-41.1±0.1）%～（45.8±0.2）%。鐵載體總含量的中位數(shù)為21.69%，將60株Kpn分為高產(chǎn)鐵載體組（鐵載體含量＞21.69%）和低產(chǎn)鐵載體組（鐵載體含量＜21.69%），見(jiàn)表2。低產(chǎn)鐵載體組的鐵載體產(chǎn)量低于高產(chǎn)鐵載體組（t=9.530，P＜0.01），見(jiàn)圖1。

表2 60株Kpn鐵載體產(chǎn)量結(jié)果（%）

圖1 肺炎克雷伯菌鐵載體產(chǎn)量比較

2.2 鐵載體基因與耐藥基因篩選結(jié)果

Kpn鐵載體基因型檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2，60株Kpn中，鐵載體基因檢出情況為:ent B85.0%（51/60）、iron B11.7%（7/60）、ybt S28.3%（17/60）。

圖2 Kpn鐵載體基因型檢測(cè)結(jié)果

60株Kpn中CRKP的檢出率為50.0%，有3株未檢出耐藥基因，27株碳青霉烯類耐藥基因陽(yáng)性。其中攜帶B類碳青霉烯酶基因（blaNDM）16株、B類碳青霉烯酶基因（blaIMP）9株、A類碳青霉烯酶基因（blaKPC）10株、D類碳青霉烯酶基因（blaOXA-48）15株，陽(yáng)性率分別為26.7%、15.0%、16.7%和25.0%。27株CRKP中，10株僅攜帶blaKPC，2株僅攜帶blaNDM，1株同時(shí)攜帶blaIMP和blaOXA-48菌 株，6株 同 時(shí) 攜 帶blaNDM和blaOXA-48菌 株，8株 同 時(shí) 攜 帶blaNDM、blaIMP和blaOXA-48菌株。

2.3 表型結(jié)果

10株blaKPC陽(yáng)性菌株中，改良碳青霉烯類失活法（mCIM）陽(yáng)性9株、陰性1株；EDTA-碳青霉烯類失活法（eCIM）陽(yáng)性1株、陰性8株、無(wú)效結(jié)果1株；2株blaNDM陽(yáng)性菌株中，mCIM和eCIM均為陽(yáng)性；1株同時(shí)攜帶blaIMP和blaOXA-48菌株，mCIM和eCIM均為陽(yáng)性；6株同時(shí)攜帶blaNDM和blaOXA-48菌株，mCIM和eCIM均為陽(yáng)性；8株同時(shí)攜帶blaNDM、blaIMP和blaOXA-48菌株，mCIM陽(yáng)性7株、陰性1株，eCIM陽(yáng)性7株、無(wú)效結(jié)果1株，部分表型結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 部分表型結(jié)果

2.4 表型試驗(yàn)結(jié)果評(píng)價(jià)

以PCR結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，mCIM試驗(yàn)的敏感度與特異度均＞90%。mCIM試驗(yàn)與PCR結(jié)果一致性較好（Kappa=0.832），見(jiàn)表4。

表4 表型試驗(yàn)結(jié)果

2.5 兩組鐵載體產(chǎn)量與鐵載體基因、耐藥基因陽(yáng)性率的比較

高產(chǎn)鐵載體組鐵載體相關(guān)基因ent B和ybt S陽(yáng)性率均高于低產(chǎn)鐵載體組，耐藥基因NDM陽(yáng)性率低于低產(chǎn)鐵載體組（P均＜0.05）。其余鐵載體相關(guān)基因和耐藥基因兩組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05），見(jiàn)表5。

表5 兩組耐藥基因、鐵載體基因陽(yáng)性率比較

2.6 產(chǎn)鐵載體能力與碳青霉烯類耐藥的關(guān)系

高產(chǎn)鐵載體組碳青霉烯類耐藥率（30%）低于低產(chǎn)鐵載體組（70%）（χ2=9.600，P＜0.01）。根據(jù)藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將60株Kpn分為碳青霉烯類藥物敏感組（30株）與耐藥組（30株），碳青霉烯類藥物耐藥組鐵載體產(chǎn)量低于敏感組（t=2.481，P＜0.05），見(jiàn)圖3。

圖3 碳青霉烯類耐藥組和敏感組鐵載體產(chǎn)量比較

3 討論

碳青霉烯類抗生素是臨床目前用于治療腸桿菌科細(xì)菌感染最為有效的抗生素，特別是針對(duì)產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶和AmpC酶的多重耐藥菌[7]。隨著該類藥物在臨床上的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，導(dǎo)致腸桿菌科細(xì)菌對(duì)其敏感性降低甚至耐藥。其中多數(shù)CRKP對(duì)幾乎所有的β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥，這對(duì)于臨床抗感染治療造成了極大的挑戰(zhàn)[8]。本研究收集的寧夏地區(qū)2019年臨床分離的60株Kpn菌株中，通過(guò)PCR檢測(cè)出有27株菌株為碳青霉烯類耐藥基因陽(yáng)性，達(dá)到了45%，且CRKP菌株的碳青霉烯酶基因以NDM為主，檢出率為30%。該結(jié)果與我國(guó)大部分地區(qū)以KPC基因型流行為主不同[9-10]，可能由于地區(qū)上的差異，不同耐藥基因的分布也有所不同，因此應(yīng)依據(jù)當(dāng)?shù)啬退幘哪退幪攸c(diǎn)來(lái)進(jìn)行抗生素的選擇。在臨床抗感染治療和防治上，鑒定CRKP產(chǎn)酶菌株具有重要意義。本項(xiàng)研究中，mCIM試驗(yàn)的敏感度為92.59%，特異度為90.90%，與PCR結(jié)果一致性較好。根據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）建議，通過(guò)eCIM實(shí)驗(yàn)初步分類了碳青霉烯酶的型別[11]。該結(jié)果顯示eCIM靈敏度較高，考慮到eCIM試驗(yàn)具有一定的局限性，只能應(yīng)用于單產(chǎn)金屬酶的檢測(cè)，如果同時(shí)攜帶其他類型的碳青霉烯酶的菌株進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，則可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果[12]，因此還應(yīng)該參考相關(guān)耐藥基因的檢測(cè)結(jié)果。

鐵是大多數(shù)生物體極其重要的生命元素，在細(xì)菌的生化代謝反應(yīng)、電子傳遞和其他生命活動(dòng)中不可或缺[13]。在缺鐵條件下，微生物會(huì)分泌一種低分子量的鐵螯合劑，稱為鐵載體。鐵載體則與細(xì)菌耐藥性有著密切聯(lián)系。部分革蘭陰性菌耐藥原因?yàn)榭股胤肿虞^大，無(wú)法進(jìn)入細(xì)菌[14]。而鐵載體－抗生素結(jié)合形成的軛合物可以轉(zhuǎn)入細(xì)菌內(nèi)，從而抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)[4]。本研究顯示肺炎克雷伯菌鐵載體的產(chǎn)量與碳青霉烯類抗生素耐藥性有關(guān)，高產(chǎn)鐵載體組耐藥率低于低產(chǎn)鐵載體組，且碳青霉烯類耐藥組產(chǎn)鐵能力低于敏感組。表明肺炎克雷伯菌碳青霉烯類抗生素的耐藥性與其產(chǎn)鐵載體能力可能存在著一定關(guān)聯(lián)性，考慮原因?yàn)椋鸿F載體含量較高，細(xì)菌更易與抗生素形成軛合物，從而使抗生素進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)殺滅病原菌。近年來(lái)，新型鐵載體藥物利用細(xì)菌自身的鐵吸收系統(tǒng)進(jìn)入細(xì)菌，使其鐵載體含量增加。該類藥物具有獨(dú)特的穿透革蘭陰性菌細(xì)胞膜的作用機(jī)制，從而克服碳青霉烯耐藥[15]。Bachman等[16]研究發(fā)現(xiàn)，從呼吸道分離的Kpn對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素敏感，ent B和ybt S陽(yáng)性率較低?？赡苡捎谥粰z測(cè)了一些鐵載體基因的攜帶情況，并未直接分析細(xì)菌產(chǎn)生鐵載體的能力，從而導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)偏差。

本研究通過(guò)對(duì)Kpn耐藥基因進(jìn)行篩選，匯總和分析了CRKP的分子流行情況，通過(guò)方法學(xué)對(duì)mCIM實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)Kpn鐵載體的產(chǎn)量與碳青霉烯類抗生素耐藥性有關(guān)。在今后的研究中，將對(duì)抗生素耐藥性與其產(chǎn)鐵載體的相關(guān)機(jī)制進(jìn)行深入探究，針對(duì)目前臨床的細(xì)菌耐藥問(wèn)題提供更加完善的理論依據(jù)。