楊常娥,魯艷莉,倪捍成,周 詠,寧喜斌,*

(1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心,上海 201306;2.大連金州新區(qū)水產(chǎn)服務(wù)管理站,遼寧大連 116100)

創(chuàng)傷弧菌產(chǎn)鐵載體菌株的篩選及其誘導(dǎo)條件的響應(yīng)面優(yōu)化

楊常娥1,魯艷莉2,倪捍成1,周 詠1,寧喜斌1,*

(1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心,上海 201306;2.大連金州新區(qū)水產(chǎn)服務(wù)管理站,遼寧大連 116100)

創(chuàng)傷弧菌是一種重要的人魚共患致病菌,根據(jù)目前已報(bào)道的致病因子,產(chǎn)鐵載體是其主要的致病因子之一。以海水中篩選分離出的創(chuàng)傷弧菌為實(shí)驗(yàn)菌株,通過改良金氏培養(yǎng)基(Modified King B,MKB)篩選產(chǎn)鐵載體菌株,通過平板覆蓋法篩選高產(chǎn)鐵載體菌株及紫外可見分光光度計(jì)法測(cè)定鐵載體活性單位(siderphore units,SU)?；贛KB培養(yǎng)基,選取產(chǎn)鐵載體能力最高的V.vulnificusY8菌株,利用響應(yīng)面法對(duì)其鐵載體活性單位的顯著影響因素包括初始pH、裝液量及碳氮比(C/N)進(jìn)行優(yōu)化。響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果表明:在初始pH7.84、裝液量81.53 mL及碳氮比(C/N)3.06的條件下,鐵載體活性單位預(yù)測(cè)值為90.7404%,并通過三次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)證明,實(shí)際平均SU值和預(yù)測(cè)SU值接近,較優(yōu)化前提高了23.73%。響應(yīng)面優(yōu)化了MKB誘導(dǎo)產(chǎn)鐵載體條件,實(shí)現(xiàn)鐵載體的高效誘導(dǎo),為日后的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

創(chuàng)傷弧菌,產(chǎn)鐵載體,MKB培養(yǎng)基,響應(yīng)面優(yōu)化

創(chuàng)傷弧菌廣泛存在于海水及海產(chǎn)品中,感染水產(chǎn)品不僅增加了水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟(jì)損失,而且存在嚴(yán)重的水產(chǎn)品食用安全隱患;感染人類,導(dǎo)致嚴(yán)重的敗血癥和胃腸炎。創(chuàng)傷弧菌的確切致病機(jī)制至今尚未完全明了。目前認(rèn)為該菌可以產(chǎn)生眾多的致病相關(guān)物質(zhì),其中鐵載體是其主要致病因子之一,另外還包括溶細(xì)胞素、金屬蛋白酶、莢膜多糖[1]等。

鐵載體(Siderophore)是生長(zhǎng)在低鐵環(huán)境中的細(xì)菌、真菌合成的一類具有高度專一性的低分子量的鐵螯合劑[2-4]。鐵是微生物生長(zhǎng)的必須微量元素,在缺鐵條件下,微生物一般依賴其分泌的螯合劑來溶解、運(yùn)輸環(huán)境中的難溶性鐵。根據(jù)目前已分離鑒定的鐵載體類型主要可歸為3類:異羥肟酸類(hydroxmate)、兒茶酚類(cateolate)和羧酸類[5]。

MKB培養(yǎng)基產(chǎn)生鐵載體的主要誘導(dǎo)條件,包括碳氮比(C/N)、初始pH、溫度、初始鹽度及裝液量等,如何確定顯著因子及最適范圍非常重要。通過單因素實(shí)驗(yàn)確定在只改變單一變量的情況下,確定各變量最適范圍,利用Plackett-Burman設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)可以從眾多的因素中篩選出顯著影響因素[6],響應(yīng)面法對(duì)關(guān)鍵因子進(jìn)行優(yōu)化,獲得目的菌株的最佳產(chǎn)鐵載體能力。

目前關(guān)于創(chuàng)傷弧菌誘導(dǎo)鐵載體條件的研究甚少,國(guó)內(nèi)外研究關(guān)于細(xì)菌鐵載體的誘導(dǎo)合成主要是通過培養(yǎng)基誘導(dǎo)和聯(lián)鐵物質(zhì)。其中培養(yǎng)基包括改良蔗糖-天冬氨酸培養(yǎng)基(Modified sugar-aspartic acid,MSA)[7]、改良金式培養(yǎng)基(Modified King B,MKB)[8]、琥珀酸鈉培養(yǎng)基(Succinate medium,SM)[9]、精氨酸培養(yǎng)基(Arginine medium,AM)[10]和檸檬酸鹽培養(yǎng)基(Citrate medium,CM)等;聯(lián)鐵物質(zhì)是指一些鐵的螯合物如2-2′聯(lián)吡啶[11-13]、8-羥基喹啉[14],主要是通過極強(qiáng)的螯合作用,使得微生物生長(zhǎng)環(huán)境處于低鐵或無鐵環(huán)境下。聯(lián)鐵物質(zhì)具有極強(qiáng)的毒性且在高溫滅菌前處理中可能釋放致癌物質(zhì),因此不利于普通實(shí)驗(yàn)室開展對(duì)鐵載體的研究。培養(yǎng)基誘導(dǎo)具有安全、穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn),但是其誘導(dǎo)產(chǎn)量一般較低。基于MKB培養(yǎng)基通過改變培養(yǎng)基碳氮源及外界環(huán)境條件,利用響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)獲得最佳鐵載體誘導(dǎo)條件,實(shí)現(xiàn)鐵載體的高效誘導(dǎo),為日后的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

創(chuàng)傷弧菌V.vulnificusY2、V.vulnificusY3、V.vulnificusY4、V.vulnificusY5、V.vulnificusY8,為本實(shí)驗(yàn)室從東海海水篩選所得;

鉻天青(Chrome azuorl S,CAS)、氯化鈉、甘油、七水硫酸鎂、α-乳糖 均為分析純國(guó)藥集團(tuán)試劑有限公司;十六烷基三甲基溴化銨(hexadecyltrimethylammonnium,HDTMA)、磷酸氫二鉀、三氯化鐵、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉 均為分析純上海凌峰有限公司;胰蛋白胨大豆肉湯、蛋白胨、酵母浸出粉 上海華康科技開發(fā)公司(上海疾控)。

增菌培養(yǎng)基-3% NaCl胰蛋白胨大豆肉湯

誘導(dǎo)培養(yǎng)基:MKB培養(yǎng)基(g/L)(其組成如下:MgSO4.7H2O 2.5 g/L;K2HPO42.5 g/L;甘油 0.5 g/L;蛋白胨5 g/L;pH7-7.2;3% NaCl等),主要用于合成鐵載體,MKB固體培養(yǎng)基添加2%瓊脂。

CAS藍(lán)色檢測(cè)液:其制備如下:溶液A:將0.079 g的CAS,溶于50 mL去離子水中,再加入10 mL 1 mmol/L的FeCl3溶液(含有10 mmol/L的HCl);溶液B:將0.069 g的HDTMA,溶于40 mL的去離子水中;溶液C:將A溶液沿著燒杯的壁緩緩加入到B溶液中,輕輕晃動(dòng),使溶液AB混勻,得到溶液C:CAS藍(lán)色檢測(cè)液[15]。

改進(jìn)CAS藍(lán)色固體檢測(cè)平板:參考文獻(xiàn)[8],將MM9緩沖液換為pH6.8的磷酸鹽緩沖液。

MKB-CAS固體檢測(cè)培養(yǎng)基:底層為MKB固體培養(yǎng)基,上層覆蓋一層CAS固體藍(lán)色檢測(cè)培養(yǎng)基。利用CAS平板覆蓋法[16]篩選產(chǎn)鐵載體菌株。

紫外可見光分光光度計(jì)UV-VIS 2300 上海天美科學(xué)儀器有限公司;臺(tái)式pH730精密測(cè)試儀 德國(guó)WTW;臺(tái)式離心機(jī)TGL-16G 上海安亭科學(xué)儀器廠。

實(shí)驗(yàn)過程中用到的所有玻璃器皿均用6 mol/L HCl浸泡過夜,然后用去離子水沖洗三遍,從而去除附著在容器上的痕量鐵,避免實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的系統(tǒng)誤差。實(shí)驗(yàn)過程中所用試劑及培養(yǎng)基均由去離子水配制,培養(yǎng)基配制器皿均為總體積250 mL的錐形瓶。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 產(chǎn)鐵載體創(chuàng)傷弧菌的篩選 將活化好的實(shí)驗(yàn)菌株用接種針點(diǎn)種于MKB培養(yǎng)基,在恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h,然后利用 MKB-CAS固體檢測(cè)培養(yǎng)基篩選出高產(chǎn)鐵載體菌株,觀察菌落周圍顏色變化,15 min內(nèi)與CAS發(fā)生顏色變化的菌株被定義為潛在型高產(chǎn)鐵載體菌株(Potentially strong siderophore producers,PSSP);而顏色變化不完全或者顏色變化時(shí)間超過12 h的菌株被定義為邊緣型產(chǎn)鐵載體菌株(Bordierline siderophore producers,BSP)[17]。

1.2.2 產(chǎn)鐵載體能力的測(cè)定 挑取單菌落于MKB培養(yǎng)基中,28 ℃、150 r/min培養(yǎng)24 h后,12000 r/min常溫離心5 min,取等體積無細(xì)胞上清液與等體積的MKB培養(yǎng)液(空白對(duì)照),同時(shí)與CAS檢測(cè)液混合,稀釋10倍,室溫下靜置1 h,紫外可見光分光光度計(jì)UV-VIS 2300測(cè)定其相對(duì)OD630。鐵載體活性單位(Sideropphore units,SU)表示鐵載體的產(chǎn)量,SU(%)=[(Ar-As)/Ar]×100,其中Ar是未接種的培養(yǎng)基與等體積CAS混合OD630,As是菌株上清與等體積CAS混合OD630。對(duì)細(xì)菌產(chǎn)鐵載體能力進(jìn)行劃分,As/Ar從1.0～0之間以0.2為間隔,每減小0.2增加一個(gè)“+”,一般產(chǎn)鐵載體能力較高的細(xì)菌其As/Ar低于0.5[18]。

1.2.3 產(chǎn)鐵載體菌株誘導(dǎo)條件的單因素實(shí)驗(yàn) 以鐵載體活性單位為指標(biāo),研究最佳碳源、氮源及其初始碳氮比、初始pH、初始鹽度、溫度、裝液量的最佳誘導(dǎo)條件。

1.2.3.1 碳源、氮源對(duì)鐵載體活性單位的影響 配制MKB培養(yǎng)基100 mL,碳源分別用葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、乳糖、纖維二糖、甘露醇、無水碳酸鈉、碳酸氫鈉替代甘油,氮源分別用硫酸銨、氯化銨、酵母浸出粉、磷酸氫二銨、草酸銨、酸水解酪蛋白替代蛋白胨。其他條件不變,培養(yǎng)24 h后,按照1.2.2方法測(cè)定相對(duì)OD630值。

1.2.3.2 初始碳氮比對(duì)鐵載體活性單位的影響 在確定最佳碳源、氮源分別為乳糖、酵母浸出粉。分別最佳碳氮比例為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1。其他條件不變,150 r/min搖床振蕩培養(yǎng)24 h后,測(cè)定相對(duì)OD630值。

1.2.3.3 初始pH對(duì)鐵載體活性單位的影響 配制MKB培養(yǎng)基100 mL,利用臺(tái)式pH精密測(cè)試儀分別調(diào)節(jié)其pH為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0,其他條件不變,CAS藍(lán)色檢測(cè)液自身顏色的變化易受到pH的影響,150 r/min搖床振蕩培養(yǎng)24 h后,將培養(yǎng)基pH調(diào)至中性后,測(cè)定相對(duì)OD630值。

1.2.3.4 初始鹽度對(duì)鐵載體活性單位的影響 配制MKB培養(yǎng)基100 mL,分別用NaCl調(diào)節(jié)其鹽度為1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%,其他條件不變,150 r/min搖床振蕩培養(yǎng)24 h后,測(cè)定相對(duì)OD630值。

1.2.3.5 溫度對(duì)鐵載體活性單位的影響 MKB培養(yǎng)基100 mL,其他條件不變,置于搖床中,分別調(diào)節(jié)其溫度為20、25、30、35、40 ℃,150 r/min搖床振蕩培養(yǎng)24 h后,其他條件不變,測(cè)定相對(duì)OD630值。

1.2.3.6 裝液量對(duì)鐵載體活性單位的影響 配制MKB培養(yǎng)基20、40、60、80、100、120 mL,其他條件不變,150 r/min搖床振蕩培養(yǎng)24 h后,測(cè)定相對(duì)OD630值。

1.2.4 Plackett-Burman設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,利用Plackett-Burman篩選出顯著影響因素。選用N=15設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn),設(shè)定三個(gè)中心點(diǎn),對(duì)初始pH、溫度、初始鹽度、裝液量及最佳碳氮比5個(gè)因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn),每個(gè)因素分別取低(-1)和高(+1)兩個(gè)水平,其中高水平大約為低水平的1.5倍[19],以鐵載體活性單位(SU)為響應(yīng)值。

1.2.5 中心組合Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn) 根據(jù)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)篩選的結(jié)果,以鐵載體活性單位為響應(yīng)值,根據(jù)Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)原理,設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)(見表1),初始鹽度及溫度分別設(shè)為初始值3%和28 ℃。

表1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因子及水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 本實(shí)驗(yàn)用Excel進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析和制圖,利用Minitab17設(shè)計(jì)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)和分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。利用Design-Expert8.0.6設(shè)計(jì)中心組合Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)和分析結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 創(chuàng)傷弧菌產(chǎn)鐵載體菌株的篩選

利用MKB-CAS固體雙層平板覆蓋法篩選出高產(chǎn)鐵載體菌株,并根據(jù)顏色變化快慢表明僅V.vulnificusY8菌株為PSSP菌株,而V.vulnificusY2、V.vulnificusY3、V.vulnificusY4、V.vulnificusY5菌株為BSP菌株,待繼續(xù)培養(yǎng)3～4 d后出現(xiàn)桔黃色暈圈。典型的產(chǎn)鐵載體菌株出現(xiàn)桔黃色暈圈見圖1A,繼續(xù)在室溫條件下放置數(shù)個(gè)星期后菌株出現(xiàn)明顯紅色暈圈見圖1B,且周圍培養(yǎng)基都變紅。通過測(cè)定實(shí)驗(yàn)菌株相對(duì)吸收波長(zhǎng)OD630值的大小計(jì)算出鐵載體活性單位和As/Ar值,并根據(jù)As/Ar值確定各個(gè)菌株分泌鐵載體能力的等級(jí),如表2所示,其中V.vulnificusY8產(chǎn)鐵載體能力為++++,鐵載體活性單位最大達(dá)到65.95%。

圖1 MKB-CAS平板篩選產(chǎn)鐵載體菌株Fig.1 Screening of siderophore-producing strains by MKB-CAS overlay plate method

表2 PSSP菌株產(chǎn)鐵載體能力Table 2 Capacity of PSSP strains producing siderophores

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 最佳初始碳氮比的確定 考察不同的碳氮源對(duì)V.vulnificusY8菌株鐵載體活性單位的影響,結(jié)果分別見圖2和圖3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在以無水碳酸鈉、碳酸氫鈉作為碳源的培養(yǎng)基中,V.vulnificusY8菌株沒有生長(zhǎng),在以葡萄糖、蔗糖、甘露醇作為碳源的培養(yǎng)基中V.vulnificusY8菌株生長(zhǎng)良好,但沒有產(chǎn)生鐵載體,在以可溶性淀粉、乳糖和纖維二糖作為碳源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好且產(chǎn)生鐵載體,產(chǎn)鐵載體能力如圖2所示,其中在乳糖作為碳源的培養(yǎng)基中鐵載體活性單位達(dá)到最高,為86.88%,確定為最佳碳源。在以草酸銨作為氮源的培養(yǎng)基中V.vulnificusY8菌株未生長(zhǎng),在以硫酸銨、氯化銨、磷酸氫二銨作為氮源的培養(yǎng)基中V.vulnificusY8菌株生長(zhǎng)良好,但未產(chǎn)生鐵載體,在以酵母浸出粉、酸水解酪蛋白為氮源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好且產(chǎn)生鐵載體,產(chǎn)鐵載體能力如圖3所示,其中在酵母浸出粉作為氮源的培養(yǎng)基中鐵載體活性單位達(dá)到最高,為86.52%,確定為最佳氮源。

圖2 碳源對(duì)鐵載體活性單位的影響Fig.2 Effects of carbon sources on siderphore units

圖3 氮源對(duì)鐵載體活性單位的影響Fig.3 Effects of nitrogen sources on siderphore units

圖4 初始碳氮比對(duì)鐵載體活性單位的影響Fig.4 Effects of initial carbon-nitrogen ration on siderphore units

其次考察不同的碳氮比對(duì)V.vulnificusY8菌株鐵載體活性單位的影響,結(jié)果見圖4。增加氮源的比例未能明顯地增加V.vulnificusY8菌株的產(chǎn)鐵載體能力;增加碳源的比例時(shí),其產(chǎn)鐵載體能力提高,變化明顯,當(dāng)碳氮比為3∶1時(shí),鐵載體活性單位達(dá)到最高,為76.95%。因此考慮氮源成本因素,確定最適碳氮比范圍為2∶1～4∶1。

2.2.2 最佳初始pH的確定 考察不同的pH條件對(duì)V.vulnificusY8菌株鐵載體活性單位的影響,結(jié)果見圖5。由圖5可知,鐵載體活性單位在酸性條件下比中性和堿性條件下要低,在pH<5.5顯著降低,pH5.5～pH7時(shí)鐵載體活性單位緩慢增加,pH7～pH8.5鐵載體活性單位基本達(dá)到最大值,保持穩(wěn)定狀態(tài)。而在pH>8.5鐵載體活性單位有明顯下降趨勢(shì),因此pH7～pH8.5時(shí)為最佳鐵載體誘導(dǎo)條件。培養(yǎng)基酸性太高,菌體自身無法生長(zhǎng)。鄧曦等[20]通過單因素實(shí)驗(yàn)研究表明創(chuàng)傷弧菌在pH6～pH8時(shí)生長(zhǎng)最佳,本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)的最佳鐵載體誘導(dǎo)條件與創(chuàng)傷弧菌生長(zhǎng)pH基本上相一致。

圖5 初始pH對(duì)鐵載體活性單位的影響Fig.5 Effects of initial pH value on siderphore units

2.2.3 最佳初始鹽度的確定 考察不同的鹽度對(duì)V.vulnificusY8菌株鐵載體活性單位的影響,結(jié)果見圖6。由圖6可知,鐵載體活性單位在鹽度為3%時(shí)達(dá)到最高,當(dāng)鹽度為1%～3%時(shí),鐵載體活性單位逐漸增長(zhǎng),高于3%后,鐵載體活性單位顯著下降。創(chuàng)傷弧菌是一種嗜鹽性海洋細(xì)菌,生長(zhǎng)需要一定的鹽度,在鹽度為0%,創(chuàng)傷弧菌將無法生長(zhǎng)。對(duì)V.vulnificusY8菌株的嗜鹽性實(shí)驗(yàn)(未發(fā)表)發(fā)現(xiàn)V.vulnificusY8菌株在TSB培養(yǎng)基生長(zhǎng)的最適鹽度為3%。同時(shí)在MKB培養(yǎng)基3%鹽度時(shí)菌株生長(zhǎng)良好,鐵載體活性單位達(dá)到最大值。因此確定其鐵載體最佳誘導(dǎo)鹽度為1%～3%。

圖6 初始鹽度對(duì)鐵載體活性單位的影響Fig.6 Effects of initial salinity on siderphore units

2.2.4 最佳溫度的確定 考察不同的溫度對(duì)V.vulnificusY8菌株鐵載體活性單位的影響,結(jié)果見圖7。在V.vulnificusY8菌株的最適生長(zhǎng)溫度實(shí)驗(yàn)中(未發(fā)表)發(fā)現(xiàn)當(dāng)溫度為20～40 ℃時(shí),隨著溫度的升高,V.vulnificusY8菌株生長(zhǎng)速率不斷增加,菌株最適生長(zhǎng)溫度范圍為35～37 ℃。由圖7可知,在溫度20～35 ℃時(shí),菌株鐵載體活性單位不斷增加;在溫度高于35 ℃時(shí),菌株生長(zhǎng)迅速,但鐵載體活性單位并未增加。因此確定最佳鐵載體活性單位溫度為25～35 ℃。

圖7 溫度對(duì)鐵載體活性單位的影響Fig.7 Effects of temperature on siderphore units

2.2.5 最佳裝液量的確定 考察不同的裝液量對(duì)V.vulnificusY8菌株鐵載體活性單位的影響,結(jié)果見圖8。由圖8可知最佳裝液量為60～100 mL。當(dāng)裝液量為20～40 mL時(shí),鐵載體活性單位無明顯變化;當(dāng)裝液量為40～60 mL時(shí),鐵載體活性單位增加。當(dāng)裝液量60～80 mL,鐵載體活性單位增加緩慢;當(dāng)裝液量80～120 mL時(shí),鐵載體活性單位逐漸減少。裝液量的高低表示培養(yǎng)基中含氧量的多少,培養(yǎng)基中適當(dāng)?shù)难鹾坑欣趧?chuàng)傷弧菌的生長(zhǎng)。

圖8 裝液量對(duì)鐵載體活性單位的影響Fig.8 Effects of medium capacity on siderphore units

2.3 Plackett-Burman設(shè)計(jì)法

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,確定各水平最佳產(chǎn)鐵載體范圍:確定最佳碳氮比為2∶1～4∶1;最佳鹽度為1%～3%;最佳裝液量為60～100 mL。初始pH為7～8.5,同時(shí)考慮乳糖在pH較高時(shí),高溫滅菌時(shí)可能發(fā)生異構(gòu)化,因此確定最佳初始pH為7～8;最佳溫度為25～35 ℃,考慮培養(yǎng)基初始培養(yǎng)溫度(未優(yōu)化前)和正負(fù)因子水平,最終確定為28～35 ℃。

利用Plackett-Burman法篩選出最顯著因素,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。利用Minitab17對(duì)表3 數(shù)據(jù)回歸方程分析,結(jié)果表明回歸方程顯著(p=0.001),R2=0.9001表明該模型可信。Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)各因素主效應(yīng)分析如表4所示,顯著性排序?yàn)?初始pH>碳氮比>裝液量>溫度>初始鹽度,確定初始pH、碳氮比及裝液量為顯著影響因素。

表3 的Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及其響應(yīng)值表(N=15)Table 3 Experimental design and response value of Plackett-Burman(N=15)

圖9 顯著影響因子對(duì)鐵載體活性單位的響應(yīng)面Fig.9 Response surface methodology of siderphore units by significant factor

表6 響應(yīng)面回歸模型ANOVA分析結(jié)果Table 6 ANOVA for Response Surface Quadratic Model analysis of variance table

注:**表示影響極其顯著,p<0.01;*表示影響顯著,p<0.05。

2.4 三因素三水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

Box-Behnken設(shè)計(jì)結(jié)果分析見表5、表6。該二次模型的多元相關(guān)系數(shù)R2=0.9987,表明僅有0.13%的變異不能由該模型解釋。對(duì)表6構(gòu)建多元回歸擬合方程,得到初始pH(X1)、裝液量(X2)、最佳碳氮比(X3)與響應(yīng)值鐵載體活性單位(Y)的關(guān)系,其方程式表達(dá)為鐵載體活性單位(SU,%)=87.18+13.20X1+1.03X2+0.57X3-0.54X1X2+1.80X1X3+0.85X2X3-9.74X12-4.68X22-14.50X32。

根據(jù)回歸方程得出三種顯著影響因素初始pH、碳氮比及裝液量的響應(yīng)面和等高線結(jié)果見圖9。結(jié)果表明:初始pH(X1)和裝液量(X2)、裝液量(X2)和最佳碳氮比(X3)交互作用不顯著,初始pH(X1)和最佳碳氮比(X3)交互作用顯著。利用Design-Expert8.0.6分析得到鐵載體活性單位最優(yōu)條件:初始pH為7.84,裝液量為81.53 mL,最佳碳氮比為3.06∶1,預(yù)測(cè)鐵載體活性單位(SU)可高達(dá)90.7404%。考慮實(shí)際操作,設(shè)定初始pH為8,裝液量為82 mL,最佳碳氮比為3∶1。

2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

按照DesignExpert8.0.6確定的最佳優(yōu)化條件,進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn),得到鐵載體活性單位為89.2311%、90.0127%、89.7842%,平均鐵載體活性單位為89.676%,實(shí)測(cè)值與模型預(yù)測(cè)值相對(duì)誤差為0.752%,說明模型預(yù)測(cè)效果良好。

3 結(jié)論

本文以海水中分離出的5株創(chuàng)傷弧菌為實(shí)驗(yàn)菌株,基于MKB培養(yǎng)基,篩選出其中鐵載體活性單位最高的V.vulnificusY8菌株進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化并得到最佳誘導(dǎo)條件,同時(shí)結(jié)合實(shí)際優(yōu)化條件,得到優(yōu)化條件:分別以乳糖和酵母浸出粉作為碳氮源且碳氮比3、初始pH8及裝液量82 mL。對(duì)于MKB培養(yǎng)基,優(yōu)化前的參數(shù):以甘油和蛋白胨作為碳氮源且碳氮比為1、初始pH6.8～7.0及裝液量100 mL,得出的平均鐵載體活性單位為69.95%。經(jīng)過優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證V.vulnificusY8的平均鐵載體活性單位為89.676%,較優(yōu)化前提高了23.73%。利用響應(yīng)面法優(yōu)化創(chuàng)傷弧菌產(chǎn)鐵載體誘導(dǎo)條件,實(shí)現(xiàn)了鐵載體的高效誘導(dǎo),解決了傳統(tǒng)培養(yǎng)基誘導(dǎo)率不高,聯(lián)鐵物質(zhì)毒性大,不利于廣泛使用等問題,為日后的鐵載體進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

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Screening of siderophore-producingVibriovulnificusand optimization of induction conditions using response surface methodology

YANG Chang-e1,LU Yan-li2,NI Han-cheng1,ZHOU Yong1,NING Xi-bin1，*

(1.Shanghai Engineering Research Center of Acquatic-Processing and Preservation,College of Food Science and Technology,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China;2.Dalian Jinzhou District Fisheries Service station,Liaoning Province,Dalian 116100,China)

Vibriovulnificusis an important pathogen. When eating infected fish,human will suffer from serious disease. To date,many potential virulence factors ofVibriovulnificushave been identified. Among the reported factors,Siderophore is a well-known crucial virulence factor. In this study,the siderophore-producing strains were screened by using MKB(Modified King B)medium which isolated from the seawater. MKB-CAS(Chrome azuorl S)overlay plate method and UV-VIS Spectrophotometer were used for the screening of high yield siderophore-producing strain and detection of SU(siderphore units)respectively.V.vulnificusY8 strain was optimized which had the highest siderophore-producing capacity. The optimization of significant factors on SU including the initial pH,medium capacity and nitrogen ratio(C/N)was determined by response surface methodology. These results indicated that the value of SU was expected to 90.7404% under the optimum condition of initial pH7.84,medium capacity of 81.53 mL and C/N of 3.06. Three parallel verification results indicated that the maximum SU value was consistent with the mean SU value and the optimized SU value was increased by 23.73% compared to the previously measured value. The best optimization conditions was obtained by using response surface methodology which would lay the foundation of the further study in the future.

Vibriovulnificus;Siderophore;MKB medium;response surface methodology

2016-07-26

楊常娥(1990-)，女，碩士研究生， 研究方向：食品微生物,E-mail：18704491561@163.com。

*通訊作者:寧喜斌(1964-)，男，博士，教授，研究方向：食品微生物、食品安全，E-mail：xbning@shou.edu.cn。

上海市科委工程中心建設(shè)(11DZ2280300)。

TS201.3

A

:1002-0306(2017)03-0159-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.03.022